| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 符号说明 | 第12-14页 |
| 前言 | 第14-19页 |
| 1 RASSF1A基因调取与腺病毒质粒构建及包装 | 第19-36页 |
| 1.1 材料与方法 | 第19-26页 |
| 1.1.1 材料 | 第19页 |
| 1.1.2 组织与细胞 | 第19页 |
| 1.1.3 仪器 | 第19页 |
| 1.1.4 配方 | 第19-21页 |
| 1.1.5 RASSF1A基因克隆 | 第21页 |
| 1.1.6 pYr-ads-4-RASSF1A质粒的构建 | 第21-22页 |
| 1.1.7 腺病毒的同源重组 | 第22页 |
| 1.1.8 准备进行转染的线性化腺病毒DNA | 第22-23页 |
| 1.1.9 将PacI线性化的腺病毒DNA转染HEK 293 | 第23-24页 |
| 1.1.10 将裂解上清液感染HEK 293 | 第24页 |
| 1.1.11 放大培养重组腺病毒 | 第24页 |
| 1.1.12 重组腺病毒的PCR验证 | 第24-25页 |
| 1.1.13 滴度检测 | 第25-26页 |
| 1.1.14 受态细胞的制备 | 第26页 |
| 1.1.15 质粒的小量及大量制备 | 第26页 |
| 1.1.16 PCR引物设计 | 第26页 |
| 1.1.17 连接反应 | 第26页 |
| 1.1.18 DNA回收,凝胶电泳 | 第26页 |
| 1.2 结果与分析 | 第26-32页 |
| 1.2.1 获得RASSF1基因完整编码区序列 | 第26-27页 |
| 1.2.2 穿梭载体pYr-ads-4-RASSF1A腺病毒构建 | 第27-29页 |
| 1.2.3 腺病毒的同源重组 | 第29页 |
| 1.2.4 包装重组腺病毒 | 第29-30页 |
| 1.2.5 滴度检测 | 第30-32页 |
| 1.3 小结 | 第32-36页 |
| 2 RASSF1A对骨肉瘤细胞系增殖的影响 | 第36-46页 |
| 2.1 材料与方法 | 第36-41页 |
| 2.1.1 抗体 | 第36页 |
| 2.1.2 主要耗材 | 第36页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第36页 |
| 2.1.4 主要溶液配制 | 第36-37页 |
| 2.1.5 细胞培养 | 第37-38页 |
| 2.1.6 免疫印迹实验步骤 | 第38-40页 |
| 2.1.7 MTT检测 | 第40页 |
| 2.1.8 数据分析 | 第40-41页 |
| 2.2 实验结果 | 第41-43页 |
| 2.2.1 免疫印迹方法检测各组骨肉瘤细胞中RASSF1A蛋白的表达水平 | 第41-42页 |
| 2.2.2 MTT方法检测RASSF1A基因过表达对细胞增殖的影响 | 第42-43页 |
| 2.3 小结 | 第43-46页 |
| 3 RASSF1A对骨肉瘤细胞凋亡和周期的影响 | 第46-54页 |
| 3.1 材料与方法 | 第46-48页 |
| 3.1.1 细胞 | 第46页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第46页 |
| 3.1.3 主要实验试剂 | 第46-47页 |
| 3.1.4 主要溶液配制 | 第47页 |
| 3.1.5 细胞培养 | 第47页 |
| 3.1.6 细胞处理 | 第47页 |
| 3.1.7 流式凋亡检测步骤 | 第47-48页 |
| 3.1.8 细胞周期检测 | 第48页 |
| 3.1.9 数据分析 | 第48页 |
| 3.2 结果与分析 | 第48-51页 |
| 3.2.1 RASSF1A对MNNG/HOSC1细胞凋亡的影响 | 第48-49页 |
| 3.2.2 流式检测RASSF1A对细胞周期的影响 | 第49-51页 |
| 3.3 小结 | 第51-54页 |
| 4 RASSF1A与骨肉瘤细胞系迁移与侵袭能力 | 第54-60页 |
| 4.1 材料与方法 | 第54-55页 |
| 4.1.1 材料 | 第54页 |
| 4.1.2 主要实验试剂及耗材 | 第54页 |
| 4.1.3 细胞培养 | 第54页 |
| 4.1.4 细胞处理 | 第54页 |
| 4.1.5 迁移实验 | 第54-55页 |
| 4.1.6 侵袭实验步骤 | 第55页 |
| 4.1.7 数据分析 | 第55页 |
| 4.2 结果与分析 | 第55-58页 |
| 4.2.1 RASSF1A对MNNG/HOSC1细胞迁移能力的影响 | 第55-57页 |
| 4.2.2 RASSF1A对MNNG/HOSC1细胞侵袭能力的影响 | 第57-58页 |
| 4.3 小结 | 第58-60页 |
| 5 RASSF1A影响骨肉瘤迁移侵袭基因表达 | 第60-75页 |
| 5.1 材料与方法 | 第60-67页 |
| 5.1.1 细胞 | 第60页 |
| 5.1.2 实验仪器 | 第60页 |
| 5.1.3 主要实验试剂及耗材 | 第60页 |
| 5.1.4 试剂配方 | 第60-62页 |
| 5.1.5 细胞培养 | 第62页 |
| 5.1.6 细胞处理 | 第62页 |
| 5.1.7 引物设计 | 第62页 |
| 5.1.8 细胞的复苏 | 第62-63页 |
| 5.1.9 细胞的传代 | 第63页 |
| 5.1.10 细胞的冻存 | 第63-64页 |
| 5.1.11 细胞收集 | 第64-65页 |
| 5.1.12 转染实验步骤 | 第65页 |
| 5.1.13 实时荧光定量PCR反应 | 第65-67页 |
| 5.1.14 数据分析 | 第67页 |
| 5.2 结果与分析 | 第67-72页 |
| 5.2.1 RASSF1A对肿瘤迁移侵袭相关基因的表达的影响 | 第67-72页 |
| 5.6 小结 | 第72-75页 |
| 6 RASSF1A与WNT信号通路的关系 | 第75-83页 |
| 6.1 材料与方法 | 第75-76页 |
| 6.1.1 细胞 | 第75页 |
| 6.1.2 实验仪器 | 第75页 |
| 6.1.3 主要实验试剂及耗材 | 第75页 |
| 6.1.4 抗体 | 第75-76页 |
| 6.1.5 细胞培养 | 第76页 |
| 6.1.6 细胞处理 | 第76页 |
| 6.1.7 WB实验步骤 | 第76页 |
| 6.2 结果与分析 | 第76-78页 |
| 6.2.1 免疫印迹实验检测各组细胞中GSK3β、P-GSK3β、β-catenin磷酸化表达水平 | 第76-77页 |
| 6.2.2 WB检测各组细胞的核蛋白中β-catenin蛋白表达水平 | 第77-78页 |
| 6.2.3 免疫印迹实验检测各组细胞中MST1/MST2磷酸化表达水平 | 第78页 |
| 6.3 小结 | 第78-83页 |
| 7 MNNG/HOSCL人骨肉瘤细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立 | 第83-89页 |
| 7.1 材料与方法 | 第83-84页 |
| 7.1.1 实验动物 | 第83页 |
| 7.1.2 细胞培养 | 第83页 |
| 7.1.3 细胞移植 | 第83页 |
| 7.1.4 肿瘤移植 | 第83-84页 |
| 7.2 结果与分析 | 第84-87页 |
| 7.2.1 人骨肉瘤细胞MNNG/HOSC1裸鼠移植瘤模型的构建 | 第84-85页 |
| 7.2.2 RASSF1A抑瘤效果分析 | 第85-87页 |
| 7.3 小结 | 第87-89页 |
| 8 讨论 | 第89-96页 |
| 9 结论 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-107页 |
| 综述 | 第107-127页 |
| 参考文献 | 第114-127页 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 | 第127-128页 |
| 致谢 | 第128页 |
