| 中文摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-20页 |
| 1. 大熊猫西氏贝蛔虫病 | 第12-15页 |
| 1.1 大熊猫与其寄生虫现状 | 第12页 |
| 1.2 西氏贝蛔虫生活史 | 第12-13页 |
| 1.3 病理变化和临床症状 | 第13页 |
| 1.4 流行病学 | 第13-14页 |
| 1.5 西氏贝蛔虫病的诊断 | 第14-15页 |
| 2. 寄生虫的脂肪酸结合蛋白 | 第15-18页 |
| 2.1 脂肪酸结合蛋白概述 | 第15-16页 |
| 2.2 寄生性蠕虫脂肪酸结合蛋白 | 第16-18页 |
| 2.2.1 吸虫和绦虫脂肪酸结合蛋白 | 第16-17页 |
| 2.2.2 线虫脂肪酸结合蛋白 | 第17-18页 |
| 3. 寄生虫的半乳糖凝集素 | 第18-19页 |
| 3.1 半乳糖凝集素概述 | 第18页 |
| 3.2 寄生虫半乳糖凝集素相关研究 | 第18-19页 |
| 4. 研究目的及意义 | 第19-20页 |
| 第二部分 研究内容 | 第20-69页 |
| 第一章 西氏贝蛔虫脂肪酸结合蛋白基因的原核表达及诊断价值的初步评价 | 第20-50页 |
| 1 材料与试剂 | 第21-25页 |
| 1.1 试验动物 | 第21页 |
| 1.2 虫体及血清样品 | 第21页 |
| 1.3 主要试剂 | 第21-23页 |
| 1.4 主要仪器 | 第23页 |
| 1.5 常用缓冲溶液和培养基的配制 | 第23-24页 |
| 1.6 主要的生物信息数据库和计算机软件 | 第24-25页 |
| 2 方法 | 第25-34页 |
| 2.1 西氏贝虫总RNA的提取 | 第25页 |
| 2.2 第一链cDNA的合成 | 第25-26页 |
| 2.3 Bs-FABP基因的扩增 | 第26-27页 |
| 2.4 PCR产物的回收 | 第27页 |
| 2.5 Bs-FABP基因克隆、鉴定及转化 | 第27-28页 |
| 2.5.1 Bs-FABP基因克隆测序 | 第27页 |
| 2.5.2 序列比对与生物信息学分析 | 第27页 |
| 2.5.3 质粒提取 | 第27-28页 |
| 2.5.4 质粒酶切回收 | 第28页 |
| 2.5.5 目的片段连接表达载体 | 第28页 |
| 2.5.6 pET32a-Bs-FABP重组质粒双酶切鉴定 | 第28页 |
| 2.6 重组Bs-FABP在大肠杆菌中的表达 | 第28-29页 |
| 2.6.1 重组蛋白的表达 | 第28-29页 |
| 2.6.2.1 重组蛋白的可溶性分析 | 第29页 |
| 2.6.2.2 SDS-PAGE电泳检测 | 第29页 |
| 2.7 重组蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| 2.8 重组蛋白免疫原性分析 | 第30-31页 |
| 2.8.1 兔抗rBs-FABP-IgG的制备 | 第30页 |
| 2.8.2 免疫印迹 | 第30-31页 |
| 2.9 免疫荧光定位 | 第31-32页 |
| 2.9.1 兔抗rBs-FABP总IgG制备 | 第31页 |
| 2.9.2 虫体蜡块的制作 | 第31页 |
| 2.9.3 间接免疫荧光定位 | 第31-32页 |
| 2.10 间接ELISA方法的建立 | 第32-33页 |
| 2.10.1 间接ELISA操作步骤 | 第32页 |
| 2.10.2 确定最佳条件 | 第32-33页 |
| 2.10.3 临界值的确定 | 第33页 |
| 2.10.4 批内重复性试验 | 第33页 |
| 2.10.5 批间重复性试验 | 第33页 |
| 2.10.6 敏感性试验 | 第33页 |
| 2.10.7 特异性试验 | 第33页 |
| 2.11 小鼠间接ELISA方法 | 第33-34页 |
| 2.11.1 感染性西氏贝蛔虫卵的培养 | 第33-34页 |
| 2.11.2 小鼠攻虫试验 | 第34页 |
| 2.11.3 临界值的确定 | 第34页 |
| 2.11.4 敏感性试验 | 第34页 |
| 3 结果 | 第34-47页 |
| 3.1 Bs-FABP基因的克隆 | 第34-35页 |
| 3.1.1 Bs-FABP基因的PCR扩增 | 第34-35页 |
| 3.1.2 重组克隆质粒PCR鉴定 | 第35页 |
| 3.1.3 重组克隆质粒序列鉴定 | 第35页 |
| 3.2 Bs-FABP基因的生物信息学分析 | 第35-39页 |
| 3.2.1 Bs-FABP基因的序列分析 | 第35-36页 |
| 3.2.3 Bs-FABP信号肽及跨膜区预测 | 第36-37页 |
| 3.2.4 Bs-FABP亲/疏水性预测 | 第37页 |
| 3.2.5 Bs-FABP蛋白的氨基酸序列同源性分析及分子进化树构建 | 第37-38页 |
| 3.2.6 Bs-FABP蛋白的二级和三级结构预测 | 第38-39页 |
| 3.3 重组pET32a(+)-Tm-FABP的表达 | 第39-40页 |
| 3.4 表达条件优化 | 第40-42页 |
| 3.4.1 IPTG浓度的优化 | 第40-41页 |
| 3.4.2 诱导时间的优化 | 第41页 |
| 3.4.3 诱导温度的优化 | 第41-42页 |
| 3.5 重组蛋白的纯化 | 第42页 |
| 3.6 重组蛋白的免疫印迹 | 第42-43页 |
| 3.7 Bs-FABP蛋白的免疫荧光定位 | 第43页 |
| 3.8 间接ELISA结果 | 第43-46页 |
| 3.8.1 抗原与血清最佳工作浓度的确定 | 第43-44页 |
| 3.8.2 酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第44-45页 |
| 3.8.3 封闭液的选择 | 第45页 |
| 3.8.4 间接ELISA阴阳性判断标准的确定 | 第45页 |
| 3.8.5 重复性检测结果 | 第45页 |
| 3.8.6 间接ELISA方法的敏感性和特异性 | 第45-46页 |
| 3.9 小鼠血清间接ELISA结果 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-50页 |
| 4.1 Bs-FABP基因生物信息学分析 | 第47页 |
| 4.2 Bs-FABP的表达与免疫印迹 | 第47页 |
| 4.3 Bs-FABP的荧光免疫 | 第47-48页 |
| 4.4 Bs-FABP间接ELISA | 第48-50页 |
| 第二章 西氏贝蛔虫半乳糖凝集素基因的原核表达及重组蛋白诊断价值的初步评价 | 第50-69页 |
| 1 材料与试剂 | 第51页 |
| 1.1 试验动物 | 第51页 |
| 1.2 虫体及血清样品 | 第51页 |
| 1.3 主要试剂 | 第51页 |
| 1.4 主要仪器 | 第51页 |
| 1.5 常用缓冲溶液和培养基的配制 | 第51页 |
| 1.6 主要生物信息数据库和计算机软件 | 第51页 |
| 2 方法 | 第51-54页 |
| 2.1 西氏贝虫总RNA的提取 | 第51-52页 |
| 2.2 第一链cDNA的合成 | 第52页 |
| 2.3 Bs-GAL基因的扩增 | 第52页 |
| 2.4 PCR产物的回收 | 第52页 |
| 2.5 Bs-GAL基因鉴定及转化 | 第52页 |
| 2.6 重组Bs-FABP在大肠杆菌中的表达 | 第52页 |
| 2.7 重组蛋白的纯化 | 第52页 |
| 2.8 重组蛋白免疫原性分析 | 第52-53页 |
| 2.9 免疫荧光定位 | 第53页 |
| 2.10 间接ELISA方法的建立 | 第53-54页 |
| 2.10.1 间接ELISA操作步骤 | 第53页 |
| 2.10.2 确定最佳条件 | 第53页 |
| 2.10.3 临界值的确定 | 第53页 |
| 2.10.4 批内重复性试验 | 第53页 |
| 2.10.5 批间重复性试验 | 第53页 |
| 2.10.6 敏感性试验 | 第53页 |
| 2.10.7 特异性试验 | 第53-54页 |
| 2.11 小鼠间接ELISA方法 | 第54页 |
| 2.11.1 感染性西氏贝蛔虫卵的培养 | 第54页 |
| 2.11.2 小鼠攻虫试验 | 第54页 |
| 2.11.3 临界值的确定 | 第54页 |
| 2.11.4 敏感性试验 | 第54页 |
| 3 结果 | 第54-66页 |
| 3.1 Bs-GAL基因的克隆 | 第54-55页 |
| 3.1.1 Bs-GAL基因的PCR扩增 | 第54-55页 |
| 3.1.2 重组克隆质粒PCR鉴定 | 第55页 |
| 3.1.3 重组克隆质粒序列鉴定 | 第55页 |
| 3.2 Bs-GAL基因的生物信息学分析 | 第55-59页 |
| 3.2.1 Bs-GAL基因的序列分析 | 第55-56页 |
| 3.2.3 Bs-GAL信号肽及跨膜区预测 | 第56-57页 |
| 3.2.4 Bs-GAL亲/疏水性预测 | 第57页 |
| 3.2.5 Bs-GAL蛋白的氨基酸序列同源性分析及分子进化树构建 | 第57-59页 |
| 3.2.6 Bs-GAL蛋白的二级和三级结构预测 | 第59页 |
| 3.3 重组pET32a(+)-Bs-GAL的表达 | 第59-60页 |
| 3.4 表达条件优化 | 第60-62页 |
| 3.4.1 IPTG浓度的优化 | 第60-61页 |
| 3.4.2 诱导时间的优化 | 第61页 |
| 3.4.3 诱导温度的优化 | 第61-62页 |
| 3.5 重组蛋白的纯化 | 第62页 |
| 3.6 重组蛋白的免疫印迹 | 第62-63页 |
| 3.7 Bs-GAL蛋白的免疫荧光定位 | 第63页 |
| 3.8 间接ELISA结果 | 第63-66页 |
| 3.8.1 抗原与血清最佳工作浓度的确定 | 第63-64页 |
| 3.8.2 酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第64-65页 |
| 3.8.3 封闭液的选择 | 第65页 |
| 3.8.4 间接ELISA阴阳性判断标准的确定 | 第65页 |
| 3.8.5 重复性检测结果 | 第65页 |
| 3.8.6 间接ELISA方法的敏感性和特异性 | 第65-66页 |
| 3.9 小鼠血清间接ELISA结果 | 第66页 |
| 4 讨论 | 第66-69页 |
| 4.1 Bs-GAL基因生物信息学分析 | 第66-67页 |
| 4.2 Bs-GAL表达和间接免疫荧光定位 | 第67页 |
| 4.3 Bs-GAL间接ELISA | 第67-69页 |
| 第三部分 结论与创新点 | 第69-70页 |
| 1. 结论 | 第69页 |
| 2. 创新点 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第82页 |
