| 摘要 | 第6-9页 |
| abstract | 第9-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-37页 |
| 1.1 苹果树腐烂病发生与防治进展 | 第17-22页 |
| 1.1.1 苹果树腐烂病发生概况 | 第17页 |
| 1.1.2 苹果树腐烂病发病规律 | 第17-18页 |
| 1.1.3 苹果树腐烂病的防治 | 第18-20页 |
| 1.1.4 苹果树腐烂病病原生物学特性 | 第20-21页 |
| 1.1.5 苹果树腐烂病菌致病机制 | 第21-22页 |
| 1.2 植物病原菌果胶酶调控研究进展 | 第22-25页 |
| 1.2.1 真菌果胶酶概述 | 第22-23页 |
| 1.2.2 植物病原真菌果胶酶的致病作用 | 第23-24页 |
| 1.2.3 植物病原真菌果胶酶调控 | 第24-25页 |
| 1.3 Velvet蛋白家族研究进展 | 第25-32页 |
| 1.3.1 Velvet蛋白家族成员 | 第25-26页 |
| 1.3.2 Velvet蛋白作用机制 | 第26-28页 |
| 1.3.3 Velvet调控作用 | 第28-32页 |
| 1.3.3.1 Velvet影响真菌发育 | 第28-29页 |
| 1.3.3.2 Velvet对次生代谢调控作用 | 第29-30页 |
| 1.3.3.3 Velvet家族蛋白对病菌致病力的影响 | 第30-31页 |
| 1.3.3.4 Velvet家族蛋白对胁迫的响应 | 第31页 |
| 1.3.3.5 Velvet家族蛋白对胞外酶的调控 | 第31-32页 |
| 1.4 环境pH响应信号PacC途径研究进展 | 第32-35页 |
| 1.4.1 PacC代谢途径 | 第32-33页 |
| 1.4.2 PacC调控作用 | 第33-35页 |
| 1.4.2.1 PacC影响病原菌致病力 | 第33-34页 |
| 1.4.2.2 PacC影响病原菌调控环境pH | 第34页 |
| 1.4.2.3 PacC影响病原菌水解酶表达 | 第34-35页 |
| 1.5 本研究的目的与意义 | 第35-37页 |
| 第二章 Velvet家族蛋白功能分析 | 第37-61页 |
| 2.1 前言 | 第37页 |
| 2.2 材料、试剂与仪器 | 第37-38页 |
| 2.2.1 供试菌株和载体 | 第37页 |
| 2.2.2 植物材料 | 第37页 |
| 2.2.3 试剂 | 第37-38页 |
| 2.2.4 仪器 | 第38页 |
| 2.3 试验方法 | 第38-45页 |
| 2.3.1 苹果树腐烂病菌Velvet家族各成员基因敲除 | 第38-41页 |
| 2.3.1.1 Double-joint方法构建靶标基因同源重组片段 | 第38-40页 |
| 2.3.1.2 野生型苹果树腐烂病菌原生质体的制备和转化 | 第40页 |
| 2.3.1.3 突变体的筛选和鉴定 | 第40页 |
| 2.3.1.4 基因敲除转化株的PCR检测 | 第40页 |
| 2.3.1.5 阳性转化株Southern blot检测 | 第40-41页 |
| 2.3.2 突变体互补 | 第41页 |
| 2.3.3 菌落形态观察和生长速率测定 | 第41页 |
| 2.3.4 致病力检测 | 第41-42页 |
| 2.3.5 胁迫敏感性检测 | 第42页 |
| 2.3.6 实时荧光定量分析试验 | 第42页 |
| 2.3.6.1 RNA提取 | 第42页 |
| 2.3.6.2 实时荧光定量分析 | 第42页 |
| 2.3.7 黑色素含量测定 | 第42页 |
| 2.3.8 酶活性测定 | 第42-43页 |
| 2.3.9 树皮果胶的免疫标记 | 第43-44页 |
| 2.3.9.1 透射电镜样品的制备 | 第43页 |
| 2.3.9.2 细胞化学标记 | 第43-44页 |
| 2.3.10 免疫共沉淀试验 | 第44-45页 |
| 2.3.10.1 载体的构建 | 第44页 |
| 2.3.10.2 总蛋白提取 | 第44页 |
| 2.3.10.3 Westernblot检测 | 第44页 |
| 2.3.10.4 蛋白亲和纯化 | 第44-45页 |
| 2.4 结果与分析 | 第45-58页 |
| 2.4.1 苹果树腐烂病菌Velvet家族基因鉴定与分析 | 第45-46页 |
| 2.4.2 苹果树腐烂病菌Velvet家族基因敲除与互补 | 第46-48页 |
| 2.4.2.1 构建Velvet敲除重组片段 | 第46页 |
| 2.4.2.2 转化株PCR验证 | 第46-48页 |
| 2.4.2.3 转化株Southern blot验证 | 第48页 |
| 2.4.2.4 Velvet基因敲除突变体互补 | 第48页 |
| 2.4.3 突变体生长和菌落形态观察 | 第48-51页 |
| 2.4.4 突变体对胁迫反应 | 第51-53页 |
| 2.4.6 突变体对致病力影响 | 第53-54页 |
| 2.4.7 突变体对果胶酶基因表达的影响 | 第54页 |
| 2.4.8 突变体对果胶的利用和果胶酶活性的影响 | 第54-55页 |
| 2.4.9 突变体对侵染过程中果胶酶活性的影响 | 第55-56页 |
| 2.4.10 免疫胶体金试验证明VmVeA和VmVelB突变对果胶降解能力影响 | 第56-57页 |
| 2.4.11 免疫共沉淀证明VmVeA和VmVelB互作 | 第57-58页 |
| 2.5 讨论 | 第58-61页 |
| 第三章 VmCmr1参与VmVeA和VmVelB对分生孢子产生的调控 | 第61-72页 |
| 3.1 前言 | 第61页 |
| 3.2 材料与方法 | 第61页 |
| 3.2.1 供试菌株和载体 | 第61页 |
| 3.2.2 试验方法 | 第61页 |
| 3.2.2.1 分生孢子萌发观察 | 第61页 |
| 3.3 结果与分析 | 第61-70页 |
| 3.3.1 VmVeA和VmVelB突变体分生孢子产生观察 | 第61-62页 |
| 3.3.2 苹果树腐烂病菌VmCmr1系统进化分析 | 第62-63页 |
| 3.3.3 VmCmr1敲除突变体构建 | 第63-65页 |
| 3.3.3.1 转化株PCR验证 | 第63-64页 |
| 3.3.3.2 转化株Southern blot验证 | 第64页 |
| 3.3.3.3 突变体互补 | 第64-65页 |
| 3.3.4 突变体生长和菌落形态观察 | 第65-66页 |
| 3.3.5 VmCmr1敲除突变体对黑色素含量影响 | 第66-67页 |
| 3.3.6 VmCmr1敲除突变体对分生孢子产生的影响 | 第67-68页 |
| 3.3.7 VmCmr1敲除突变体对分生孢子萌发的影响 | 第68-69页 |
| 3.3.8 突变体对致病力影响 | 第69-70页 |
| 3.4 讨论 | 第70-72页 |
| 第四章 pH响应信号途径转录因子PacC功能分析 | 第72-92页 |
| 4.1 前言 | 第72页 |
| 4.2 材料与方法 | 第72-74页 |
| 4.2.1 供试菌株和载体 | 第72-73页 |
| 4.2.2 试验方法 | 第73-74页 |
| 4.2.2.1 基因敲除和互补 | 第73页 |
| 4.2.2.2 PacC在不同pH和侵染中转录水平测定 | 第73页 |
| 4.2.2.3 不同pH生长速率测定 | 第73页 |
| 4.2.2.4 培养基和树皮pH测定 | 第73页 |
| 4.2.2.5 致病力测定 | 第73页 |
| 4.2.2.6 胁迫敏感性检测 | 第73-74页 |
| 4.2.2.7 有机酸含量测定 | 第74页 |
| 4.2.2.7 果胶酶qRT-PCR分析试验 | 第74页 |
| 4.2.2.8 激活态PacC突变体构建 | 第74页 |
| 4.2.2.9 激活态突变体酶活性测定 | 第74页 |
| 4.3 结果与分析 | 第74-89页 |
| 4.3.1 苹果树腐烂病菌Pal信号通路基因预测与系统进化分析 | 第74-75页 |
| 4.3.2 苹果树腐烂病菌VmPacC在不同pH和侵染过程中表达动态 | 第75-76页 |
| 4.3.3 苹果树腐烂病菌VmPacC基因敲除和互补 | 第76-78页 |
| 4.3.3.1 敲除重组片段的构建 | 第76-77页 |
| 4.3.3.2 转化株PCR和Southern blot验证及互补 | 第77-78页 |
| 4.3.4 苹果树腐烂病菌在不同pH条件下生长 | 第78页 |
| 4.3.5 VmPacC基因敲除对pH适应性影响 | 第78-79页 |
| 4.3.6 VmPacC参与环境pH酸化 | 第79-80页 |
| 4.3.7 VmPacC参与寄主pH酸化 | 第80-81页 |
| 4.3.8 突变体对胁迫反应 | 第81页 |
| 4.3.9 突变体对致病力影响 | 第81-82页 |
| 4.3.10 突变体对病菌有机酸产生影响 | 第82-84页 |
| 4.3.11 突变体对果胶酶基因表达的影响 | 第84-85页 |
| 4.3.12 VmPacC活性态突变体构建 | 第85-86页 |
| 4.3.13 VmPacC活性态突变体致病力 | 第86-87页 |
| 4.3.14 VmPacC活性态突变体影响果胶生长 | 第87-88页 |
| 4.3.15 VmPacC活性态突变体不同pH诱导条件下对果胶酶基因的调控作用 | 第88页 |
| 4.3.16 VmPacC活性态突变体不同pH诱导条件下对果胶酶活性影响 | 第88-89页 |
| 4.4 讨论 | 第89-92页 |
| 第五章 全文结论与展望 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-109页 |
| 附录 | 第109-118页 |
| 附录1 黑色素果胶酶基因 | 第109-110页 |
| 附录2 引物 | 第110-114页 |
| 附录3 培养基配方 | 第114-116页 |
| 附录4 试剂配制 | 第116-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
| 作者简介 | 第119-120页 |
