| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 绪论 | 第11-16页 |
| 1.1 青霉素简介 | 第11页 |
| 1.2 青霉素的研究和应用 | 第11-14页 |
| 1.2.1 青霉素的由来 | 第11页 |
| 1.2.2 青霉素的作用机制 | 第11-12页 |
| 1.2.3 青霉素的不良反应 | 第12页 |
| 1.2.4 青霉素的种类 | 第12页 |
| 1.2.5 青霉素的合成过程中的几种关键酶 | 第12-14页 |
| 1.3 国内外研发现状 | 第14页 |
| 1.4 课题研究的意义与主要研究内容 | 第14-16页 |
| 1.4.1 研究意义 | 第14-15页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第15-16页 |
| 第2章 筛选模型的建立 | 第16-21页 |
| 2.1 材料和仪器 | 第16-17页 |
| 2.1.1 菌株及载体 | 第16页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第16页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第16-17页 |
| 2.2 酶活检测方法及筛选模型的研究 | 第17-18页 |
| 2.2.1 6APA 的检测 | 第17页 |
| 2.2.2 筛选模型的建立 | 第17-18页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第18-20页 |
| 2.3.1 6APA 的检测 | 第18页 |
| 2.3.2 固体培养基模型 | 第18-19页 |
| 2.3.3 定性检测模型 | 第19-20页 |
| 2.4 本章小结 | 第20-21页 |
| 第3章 产黄青霉异青霉素N 酰基转移酶基因的克隆及表达 | 第21-48页 |
| 3.1 材料和仪器 | 第21-24页 |
| 3.1.1 菌株及载体 | 第21页 |
| 3.1.2 培养基 | 第21页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第21-23页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第23-24页 |
| 3.2 实验方法 | 第24-33页 |
| 3.2.1 产黄青霉总RNA 的提取 | 第24-25页 |
| 3.2.2 RT-PCR 反应获得6APA 酰基转移酶基因（penDE）基因全长cDNA | 第25-26页 |
| 3.2.3 PCR 引物设计与目的基因的获得 | 第26-28页 |
| 3.2.4 目的基因DNA 的纯化与回收 | 第28页 |
| 3.2.5 克隆载体penDE-PEASY-T1 的构建及测序 | 第28-32页 |
| 3.2.6 pET-penDE 表达载体的构建 | 第32-33页 |
| 3.3 重组6APA 酰基转移酶基因在E.coli 中的诱导表达 | 第33-35页 |
| 3.3.1 SDS-PAGE 电泳 | 第33-35页 |
| 3.3.2 粗酶液制备 | 第35页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第35-47页 |
| 3.4.1 产黄青霉（Penicillium chrysogenum）总RNA 的获得 | 第35-36页 |
| 3.4.2 penDE 基因克隆 | 第36-37页 |
| 3.4.3 克隆载体penDE-pEASY/T1 的构建与鉴定 | 第37-42页 |
| 3.4.4 表达载体pET-penDE 的构建及鉴定 | 第42-43页 |
| 3.4.5 质粒构建流程图 | 第43-44页 |
| 3.4.6 IAT在E. coli 中的表达以及SDS-PAGE 分析 | 第44页 |
| 3.4.7 诱导培养条件的优化 | 第44-47页 |
| 3.5 本章小结 | 第47-48页 |
| 第4章 异青霉素N 酰基转移酶的纯化与酶学性质 | 第48-56页 |
| 4.1 材料与仪器 | 第48页 |
| 4.1.1 菌株及试剂 | 第48页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第48页 |
| 4.2 实验方法 | 第48-51页 |
| 4.2.1 菌体的裂解 | 第48-49页 |
| 4.2.2 蛋白质的分离纯化 | 第49页 |
| 4.2.3 凝胶过滤法 | 第49-50页 |
| 4.2.4 组氨酸标签蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| 4.3 纯化酶的制备 | 第51-52页 |
| 4.3.1 酶纯化的预实验 | 第51页 |
| 4.3.2 酶的纯化 | 第51-52页 |
| 4.4 产黄青霉对不同侧链前体的利用情况研究 | 第52页 |
| 4.5 纯化酶的底物特异性验证 | 第52-53页 |
| 4.6 结果与讨论 | 第53-55页 |
| 4.6.1 通过抑菌圈表征酶的目标性质酶活的大小 | 第53页 |
| 4.6.2 SDS-PAGE 检测重组蛋白IAT | 第53-54页 |
| 4.6.3 纯化酶的酶活测定及底物特异性的验证 | 第54-55页 |
| 4.7 本章小结 | 第55-56页 |
| 第5章 异青霉素N 酰基转移酶的定向进化 | 第56-62页 |
| 5.1 材料 | 第56-57页 |
| 5.1.1 菌株与质粒 | 第56页 |
| 5.1.2 试剂 | 第56-57页 |
| 5.1.3 仪器设备与耗材 | 第57页 |
| 5.2 体外定向进化策略的选择 | 第57页 |
| 5.3 实验方法 | 第57-58页 |
| 5.3.1 易错PCR 构建IAT 突变体库 | 第57-58页 |
| 5.3.2 复筛反应体系 | 第58页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第58-61页 |
| 5.4.1 易错PCR | 第58-59页 |
| 5.4.2 IAT 突变体库的构建 | 第59页 |
| 5.4.3 复筛结果 | 第59-61页 |
| 5.5 本章小结 | 第61-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
