| 摘要 | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-17页 |
| 1 猪肺炎支原体概述 | 第9页 |
| 2 猪肺炎支原体致病机理及相关免疫原蛋白的研究 | 第9-13页 |
| 2.1 猪肺炎支原体致病机理概述 | 第9页 |
| 2.2 Mhp致病机理研究进展 | 第9-11页 |
| 2.2.1 Mhp入侵机制研究进展 | 第9-10页 |
| 2.2.2 Mhp损伤及凋亡机制研究进展 | 第10-11页 |
| 2.3 猪肺炎支原体毒力相关因子的研究进展 | 第11-12页 |
| 2.4 病原与宿主互作研究 | 第12-13页 |
| 3 烯醇化酶生物功能研究进展 | 第13页 |
| 4 烯醇化酶在病原菌方面的研究进展 | 第13-15页 |
| 5 烯醇化酶在支原体方面研究进展 | 第15-17页 |
| 第二章 猪肺炎支原体烯醇化酶基因的原核克隆表达及鉴定 | 第17-32页 |
| 1 试验材料 | 第17-18页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第17页 |
| 1.2 主要材料与试剂 | 第17页 |
| 1.3 试验仪器 | 第17-18页 |
| 2 试验方法 | 第18-25页 |
| 2.1 引物的设计与合成 | 第18页 |
| 2.2 Mhp168菌液DNA的提取 | 第18页 |
| 2.3 Mhp/Eno基因的PCR扩增 | 第18-19页 |
| 2.4 目的基因的回收及纯化 | 第19页 |
| 2.5 Mhp Eno基因与pMD18-T载体的连接 | 第19-20页 |
| 2.6 连接产物转化 | 第20页 |
| 2.7 重组质粒DNA的提取、鉴定及测序 | 第20-21页 |
| 2.7.1 重组质粒的提取 | 第20页 |
| 2.7.2 重组质粒的PCR鉴定 | 第20页 |
| 2.7.3 重组质粒的酶切鉴定 | 第20-21页 |
| 2.7.4 重组质粒的测序鉴定 | 第21页 |
| 2.8 载体pGEX-4T-1的获取 | 第21页 |
| 2.9 构建pGEX-4T-1/Mhp Eno表达载体 | 第21-22页 |
| 2.10 连接产物的转化、重组质粒DNA的提取及鉴定 | 第22页 |
| 2.10.1 连接产物的转化 | 第22页 |
| 2.10.2 重组质粒DNA的提取 | 第22页 |
| 2.10.3 重组质粒的PCR鉴定 | 第22页 |
| 2.10.4 重组质粒的酶切鉴定 | 第22页 |
| 2.10.5 重组质粒的测序鉴定 | 第22页 |
| 2.11 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第22-23页 |
| 2.11.1 重组质粒的诱导表达 | 第22页 |
| 2.11.2 表达产物的SDS-PAGE检测 | 第22-23页 |
| 2.11.3 最佳诱导条件的确定 | 第23页 |
| 2.11.4 表达产物的存在状态分析 | 第23页 |
| 2.12 蛋白的纯化 | 第23-24页 |
| 2.13 表达产物的Western-blot检测 | 第24-25页 |
| 3 结果与分析 | 第25-30页 |
| 3.1 基因的获取 | 第25页 |
| 3.2 猪肺炎支原体Eno基因的扩增结果 | 第25-26页 |
| 3.3 pMD18-T/Eno的双酶切鉴定结果 | 第26页 |
| 3.4 pMD18-T/Eno的PCR鉴定结果 | 第26-27页 |
| 3.5 pGEX-4T-1/Eno的双酶切鉴定结果 | 第27页 |
| 3.6 pGEX-4T-1/Eno的PCR鉴定结果 | 第27-28页 |
| 3.7 诱导蛋白的SDS-PAGE结果 | 第28页 |
| 3.8 筛选诱导表达条件的结果 | 第28-29页 |
| 3.9 纯化蛋白的结果 | 第29-30页 |
| 3.10 表达产物的Western-blot的鉴定 | 第30页 |
| 4 小结 | 第30-32页 |
| 第三章 猪肺炎支原体烯醇化酶的部分生物学功能分析 | 第32-42页 |
| 试验一 Mhp rEno蛋白免疫原性分析 | 第32-36页 |
| 1 材料 | 第32页 |
| 1.1 仪器 | 第32页 |
| 1.2 试验材料及耗材 | 第32页 |
| 2 方法 | 第32-34页 |
| 2.1 测定蛋白质浓度 | 第32页 |
| 2.2 BALB/c小鼠的免疫 | 第32-33页 |
| 2.3 间接ELISA方法 | 第33页 |
| 2.4 检测Mhp rEno蛋白免疫小鼠抗体水平 | 第33页 |
| 2.5 鼠抗Mhp rEno血清与不同Mhp菌株反应试验 | 第33-34页 |
| 2.5.1 制备全菌蛋白 | 第33页 |
| 2.5.2 鼠抗Mhp rEno血清与不同菌株蛋白反应 | 第33-34页 |
| 3 结果 | 第34-36页 |
| 3.1 Mhp rEno蛋白免疫小鼠抗体水平 | 第34页 |
| 3.2 不同菌株蛋白反应试验 | 第34-36页 |
| 试验二 猪肺炎支原体烯醇化酶蛋白对STEC细胞的黏附及黏附抑制作用分析 | 第36-40页 |
| 1 试验材料 | 第36页 |
| 2 试验方法 | 第36-38页 |
| 2.1 STEC细胞膜蛋白的制备 | 第36页 |
| 2.2 微孔板检测 | 第36-37页 |
| 2.3 间接免疫荧光检测Mhp rEno蛋白抗Mhp黏附STEC细胞 | 第37页 |
| 2.4 间接免疫荧光检测Mhp rEno抗体抗Mhp黏附STEC细胞 | 第37-38页 |
| 3 试验结果 | 第38-40页 |
| 3.1 微孔板黏附试验定量检测蛋白黏附能力结果 | 第38页 |
| 3.2 间接免疫荧光检测Mhp rEno蛋白抗Mhp黏附STEC细胞结果 | 第38-39页 |
| 3.3 间接免疫荧光检测Mhp rEno抗体抗Mhp黏附STEC细胞结果 | 第39-40页 |
| 试验三 猪肺炎支原体烯醇化酶蛋白对STEC细胞的损伤分析 | 第40-42页 |
| 1 试验材料 | 第40页 |
| 1.1 细胞 | 第40页 |
| 1.2 主要试剂 | 第40页 |
| 1.3 主要仪器 | 第40页 |
| 2 试验方法 | 第40-41页 |
| 2.1 Mhp rEno蛋白对STEC细胞活力的影响 | 第40-41页 |
| 2.1.1 STEC细胞培养 | 第40页 |
| 2.1.2 Mhp制备 | 第40页 |
| 2.1.3 CCK-8细胞活力试剂盒测定不同浓度Mhp rEno对STEC细胞的损伤 | 第40-41页 |
| 2.1.4 DAPI染色观察细胞损伤的形态变化 | 第41页 |
| 3 试验结果 | 第41-42页 |
| 3.1 CCK-8细胞活力检测试剂盒检测Mhp rEno蛋白的存在对STEC细胞的影响结果 | 第41-42页 |
| 3.2 Mhp rEno蛋白的存在对STEC细胞损伤后DAPI染色结果 | 第42页 |
| 总结 | 第42-44页 |
| 讨论 | 第44-46页 |
| 结论 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-52页 |
| Abstract | 第52-53页 |
| 附录 | 第54-56页 |
| 致谢 | 第56页 |
