| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 缩略词表 | 第11-13页 |
| 第一章 引言 | 第13-45页 |
| 第一节 常染色体显性多囊肾病 | 第13-26页 |
| ·常染色体显性多囊肾病的病理特征 | 第13-15页 |
| ·常染色体显性多囊肾病的致病基因 | 第15-17页 |
| ·常染色体显性多囊肾病的基因突变 | 第17-20页 |
| ·常染色体显性多囊肾病的遗传理论 | 第20-22页 |
| ·常染色体显性多囊肾病的发病机制 | 第22-26页 |
| 第二节 ADPKD的啮齿类动物模型 | 第26-30页 |
| ·自发模型和化学药物诱导模型 | 第26页 |
| ·转基因模型 | 第26-28页 |
| ·基因敲除模型 | 第28-30页 |
| 第三节 小型猪作为肾脏疾病模型的优点 | 第30-32页 |
| 第四节 类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN) | 第32-39页 |
| ·TALE结合方式 | 第32页 |
| ·天然TALE和FokI融合蛋白 | 第32-33页 |
| ·人工TALEN合成方法 | 第33-35页 |
| ·TALEN介导的基因组编辑 | 第35-37页 |
| ·TALEN的优化 | 第37-39页 |
| 第五节 成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9) | 第39-44页 |
| ·CRISPR-Cas免疫机制 | 第39-40页 |
| ·CRISPR-Cas9系统的人工改造和应用 | 第40-44页 |
| 第六节 本研究的目的和意义 | 第44-45页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第45-66页 |
| 第一节 实验材料 | 第45-50页 |
| ·菌株和质粒 | 第45页 |
| ·实验动物和细胞 | 第45页 |
| ·实验试剂和耗材 | 第45-49页 |
| ·实验仪器 | 第49-50页 |
| ·分析软件和工具 | 第50页 |
| 第二节 实验方法 | 第50-66页 |
| ·组织和细胞基因组DNA提取 | 第50-51页 |
| ·组织和细胞RNA提取 | 第51-52页 |
| ·组织蛋白提取 | 第52页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第52页 |
| ·普通PCR | 第52-53页 |
| ·PCR和酶切产物回收 | 第53页 |
| ·连接反应 | 第53-54页 |
| ·感受态细胞制备(CaCl_2法) | 第54页 |
| ·菌体PCR鉴定重组质粒 | 第54页 |
| ·质粒提取 | 第54-56页 |
| ·Southern Blot | 第56-57页 |
| ·Westem Blot | 第57-58页 |
| ·免疫组织化学染色(IHC) | 第58-59页 |
| ·小型猪血液生理生化检测 | 第59页 |
| ·DNA寡核苷酸退火 | 第59-60页 |
| ·CRISPR-Cas9质粒构建 | 第60页 |
| ·核转染TALEN、CRISPR-Cas9质粒和细胞培养 | 第60页 |
| ·T7E1酶切 | 第60-61页 |
| ·5'RACE | 第61-63页 |
| ·3'RACE | 第63-64页 |
| ·cDNA逆转录 | 第64页 |
| ·实时定量PCR(qRT-PCR) | 第64-65页 |
| ·脂质体转染 | 第65页 |
| ·双荧光素酶检测 | 第65-66页 |
| 第三章 c-Myc转基因猪ADPKD模型的构建 | 第66-76页 |
| 第一节 pKsp-c-Myc-b转基因载体的构建 | 第66-70页 |
| ·改造pTargeT载体 | 第66-67页 |
| ·猪c-Myc基因的克隆 | 第67页 |
| ·小鼠肾脏特异表达基因Ksp-Cadherin启动子的克隆 | 第67-68页 |
| ·pKsp-c-Myc-b转基因载体 | 第68-70页 |
| 第二节 c-Myc转基因猪的产生和鉴定 | 第70-72页 |
| ·c-Myc转基因阳性单克隆细胞的筛选 | 第70页 |
| ·c-Myc转基因单克隆细胞核移植、胚胎移植和Fo代猪 | 第70-71页 |
| ·Southern Blot检测F_0代转基因猪 | 第71-72页 |
| 第三节 c-Myc转基因猪的表型检测 | 第72-74页 |
| ·Western Blot和IHC检测 | 第72-73页 |
| ·转基因猪血尿素氮和血肌酐检测 | 第73页 |
| ·c-Myc转基因猪的长期观察 | 第73-74页 |
| 第四节 结果讨论和分析 | 第74-76页 |
| 第四章 TALEN介导的猪PKD2基因突变 | 第76-84页 |
| 第一节 猪PKD2基因TALEN靶点的选择 | 第76-77页 |
| 第二节 在LLC-PK1细胞上检测TALEN效率 | 第77-78页 |
| 第三节 在CEMP胎儿成纤维细胞上突变PKD2基因 | 第78-83页 |
| ·在CEMP胎儿成纤维细胞上检测TALEN突变效率 | 第78-80页 |
| ·TALEN识别位点的优化 | 第80-81页 |
| ·尝试T-93和单链DNA介导的点突变 | 第81-83页 |
| 第四节 结果讨论与分析 | 第83-84页 |
| 第五章 CRISPR-Cas9介导的猪PKD2基因敲除 | 第84-87页 |
| 第六章 猪CDH16基因的克隆、肾脏表达鉴定和启动子分析 | 第87-97页 |
| 第一节 猪CDH16基因的克隆 | 第87-91页 |
| ·猪CDH16基因测序 | 第87-88页 |
| ·猪CDH16基因5’RACE | 第88-89页 |
| ·猪CDH16基因3’RACE | 第89-90页 |
| ·猪CDH16基因cDNA的克隆 | 第90-91页 |
| 第二节 猪CDH16基因的肾脏表达鉴定 | 第91-93页 |
| 第三节 猪CDH16基因的启动子分析 | 第93-95页 |
| 第四节 结果讨论和分析 | 第95-97页 |
| 第七章 结论与展望 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-118页 |
| 附录 | 第118-139页 |
| 附录一 各章节所使用的引物、单链DNA和寡核苷酸序列 | 第118-122页 |
| 1、第三章 | 第118页 |
| 2、第四章 | 第118-119页 |
| 3、第五章 | 第119-120页 |
| 4、第六章 | 第120-122页 |
| 附录二 TALEN相关序列 | 第122-126页 |
| 1、TALEN识别序列和对应重复可变双残基(RVD)氨基酸 | 第122页 |
| 2、T-93编码序列和氨基酸序列 | 第122-126页 |
| 附录三 猪CDH16基因及其cDNA、CDS和蛋白序列 | 第126-136页 |
| 1、猪CDH16基因序列 | 第126-132页 |
| 2、猪CDH16基因的cDNA序列 | 第132-133页 |
| 3、猪CDH16基因的编码序列(CDS) | 第133-134页 |
| 4、猪CDH16基因的蛋白序列(833aa) | 第134-136页 |
| 附录四 人类、小鼠和猪Cadherin16蛋白序列比对 | 第136-138页 |
| 附录五 猪CDH16基因上游1981bp可能存在的转录因子结合位点 | 第138-139页 |
| 致谢 | 第139-140页 |
| 个人简历 | 第140页 |
