| 摘要 | 第1-6页 |
| abstract | 第6-13页 |
| 主要符号对照表 | 第13-14页 |
| 第1章 引言 | 第14-35页 |
| ·研究意义 | 第14-15页 |
| ·研究背景 | 第15-30页 |
| ·RNA干扰 | 第15-21页 |
| ·腺相关病毒 | 第21-25页 |
| ·端粒酶 | 第25-30页 |
| ·研究内容 | 第30-31页 |
| ·方法路线 | 第31-33页 |
| ·ami RNA的设计与筛选 | 第31-32页 |
| ·scrAAV-amiRNA的构建与验证 | 第32页 |
| ·scrAAV-amiRNA的优化与分析 | 第32-33页 |
| ·论文结构 | 第33-35页 |
| ·引言 | 第33页 |
| ·amiRNA的设计与筛选 | 第33页 |
| ·scrAAV-amiRNA的构建与验证 | 第33页 |
| ·scrAAV-amiRNA的优化与分析 | 第33页 |
| ·结论 | 第33-35页 |
| 第2章 amiRNA的设计与筛选 | 第35-65页 |
| ·材料 | 第35-37页 |
| ·实验对象 | 第35页 |
| ·实验耗材 | 第35页 |
| ·实验试剂 | 第35-36页 |
| ·实验设备 | 第36-37页 |
| ·方法 | 第37-47页 |
| ·amiRNA的设计、合成、配制 | 第37页 |
| ·细胞培养 | 第37-38页 |
| ·amiRNA转染 | 第38页 |
| ·siRNA 标记转染 | 第38-39页 |
| ·RNA 提取 | 第39页 |
| ·普通 RT-PCR | 第39-40页 |
| ·荧光定量 PCR | 第40页 |
| ·蛋白电泳 | 第40-42页 |
| ·Western Blot | 第42-43页 |
| ·端粒酶活性测定 | 第43-44页 |
| ·MTT 实验 | 第44页 |
| ·流式细胞术 | 第44页 |
| ·细胞凋亡染色 | 第44-45页 |
| ·线粒体膜电位检测 | 第45页 |
| ·Transwell 实验 | 第45-46页 |
| ·小管生成实验 | 第46页 |
| ·软琼脂克隆形成实验 | 第46-47页 |
| ·amiRNA 靶点克隆沉默实验 | 第47页 |
| ·裸鼠成瘤实验 | 第47页 |
| ·数据统计分析 | 第47页 |
| ·结果与分析 | 第47-63页 |
| ·设计、合成 2 对最佳 amiRNA 序列 | 第47-48页 |
| ·amiRNA 高效转染目的实验细胞 | 第48-49页 |
| ·amiRNA 显著下调 hTERT 的表达 | 第49-50页 |
| ·amiRNA 显著下调端粒酶活性 | 第50-51页 |
| ·amiRNA 特异性改变 hTERT 阳性肿瘤细胞的形态 | 第51-52页 |
| ·amiRNA 特异性抑制 hTERT 阳性肿瘤细胞的增殖 | 第52-54页 |
| ·amiRNA 特异性促进 hTERT 阳性肿瘤细胞的凋亡 | 第54-57页 |
| ·amiRNA 显著抑制细胞迁移和血管生成 | 第57-58页 |
| ·amiRNA 有效降低 hTERT 阳性肿瘤细胞的成瘤能力 | 第58-60页 |
| ·amiRNA-hTERT 主要通过影响 P53 信号通路发挥作用 | 第60-62页 |
| ·amiRNA 的特异性与安全性 | 第62-63页 |
| ·结论 | 第63-65页 |
| 第3章 scrAAV-amiRNA 的构建与验证 | 第65-81页 |
| ·材料 | 第65-66页 |
| ·实验对象 | 第65页 |
| ·实验耗材 | 第65页 |
| ·实验试剂 | 第65页 |
| ·实验设备 | 第65-66页 |
| ·方法 | 第66-71页 |
| ·pcDNA6.2-amiRNA 载体构建 | 第66页 |
| ·scrAAV-amiRNA 载体构建 | 第66-67页 |
| ·质粒大提 | 第67页 |
| ·细胞培养 | 第67页 |
| ·病毒生产 | 第67-68页 |
| ·病毒基因组提取 | 第68页 |
| ·Stem-loop miRNA RT-qPCR | 第68-69页 |
| ·PAGE 蛋白电泳 | 第69页 |
| ·银染 | 第69-71页 |
| ·数据统计分析 | 第71页 |
| ·结果与分析 | 第71-79页 |
| ·成功构建 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 质粒载体 | 第71-72页 |
| ·三质粒共转法包装 scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 病毒载体 | 第72页 |
| ·病毒滴度直接测定法的建立 | 第72-76页 |
| ·scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 病毒表征 | 第76-77页 |
| ·scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 对外源基因的表达 | 第77-78页 |
| ·scrAAV- pcDNA6.2-amiRNA 对靶基因的沉默效应 | 第78-79页 |
| ·结论 | 第79-81页 |
| 第4章 scrAAV-amiRNA 的优化与分析 | 第81-106页 |
| ·材料 | 第81页 |
| ·实验对象 | 第81页 |
| ·实验耗材 | 第81页 |
| ·实验试剂 | 第81页 |
| ·实验设备 | 第81页 |
| ·方法 | 第81-87页 |
| ·miRNA 深度测序表达谱数据整理 | 第81-82页 |
| ·主要 miRNA 及主要 pre-miRNA 数据组的建立 | 第82页 |
| ·成熟 miRNA 序列分类 | 第82-84页 |
| ·成熟 miRNA 序列分析 | 第84页 |
| ·主要 miRNA 的特征分析 | 第84-85页 |
| ·主要 pre-miRNA 的特征分析 | 第85-86页 |
| ·候选 miRNA 表达框的选择 | 第86页 |
| ·优化型 scrAAV-amiRNA 载体的构建 | 第86页 |
| ·病毒生产及质控 | 第86页 |
| ·amiRNA 定量分析 | 第86页 |
| ·数据统计分析 | 第86-87页 |
| ·结果与分析 | 第87-103页 |
| ·scrAAV-pcDNA6.2-amiRNA 不能高效表达 amiRNA | 第87页 |
| ·成功构建覆盖范围广、重复性高的试验数据组 | 第87-88页 |
| ·成功构建主要 miRNA 数据组 | 第88-89页 |
| ·成功构建主要 pre-miRNA 数据组 | 第89-90页 |
| ·miRNA 成熟序列的系统分类结果 | 第90-92页 |
| ·不同物种间 miRNA 表达框的通用性分析 | 第92-97页 |
| ·确定候选 miRNA | 第97页 |
| ·确定 miRNA 表达框的长度 | 第97-99页 |
| ·优化后的 scrAAV-opt-amiRNA 表达分析 | 第99-100页 |
| ·影响 scrAAV-amiRNA 表达性能因素分析 | 第100-103页 |
| ·结论 | 第103-106页 |
| 第5章 结论 | 第106-110页 |
| ·主要工作 | 第106-107页 |
| ·主要成果 | 第107-108页 |
| ·创新点 | 第108页 |
| ·局限性 | 第108-109页 |
| ·工作展望 | 第109-110页 |
| 参考文献 | 第110-119页 |
| 致谢 | 第119-122页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 | 第122-123页 |
