| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-31页 |
| ·甾体皂苷的研究概况 | 第14-18页 |
| ·甾体皂苷化学结构特征 | 第14-15页 |
| ·甾体皂苷的药理作用 | 第15-17页 |
| ·甾体皂苷的开发利用状况 | 第17-18页 |
| ·甾体皂苷应用于中药制剂及保健食品 | 第17页 |
| ·甾体皂苷应用于制备薯蓣皂苷元 | 第17-18页 |
| ·甾体皂苷应用于开发新药的展望 | 第18页 |
| ·糖苷酶应用于配糖体化合物糖链结构的修饰 | 第18-24页 |
| ·配糖体化合物糖链结构与其生物活性的关系 | 第19-20页 |
| ·配糖体化合物糖链结构修饰的研究进展 | 第20-22页 |
| ·化学法 | 第20-21页 |
| ·生物酶法 | 第21-22页 |
| ·配糖体糖苷酶的研究进展 | 第22-24页 |
| ·真核生物全长基因克隆的策略 | 第24-26页 |
| ·全长基因的克隆方法 | 第24-25页 |
| ·基因文库筛选法 | 第24页 |
| ·PCR技术 | 第24-25页 |
| ·电子克隆法 | 第25页 |
| ·简并PCR方法和其他PCR方法结合克隆基因全长 | 第25-26页 |
| ·毕赤酵母表达系统在真核生物基因表达中的策略 | 第26-30页 |
| ·毕赤酵母表达宿主菌株 | 第27-28页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第28-29页 |
| ·表达载体的转化以及与毕赤酵母的整合 | 第29页 |
| ·外源蛋白在毕赤酵母中表达和修饰 | 第29-30页 |
| ·本论文的选题意义 | 第30页 |
| ·本论文的研究内容 | 第30-31页 |
| 第二章 穿龙薯蓣中主要甾体皂苷的分离鉴定 | 第31-39页 |
| ·引言 | 第31-32页 |
| ·材料与方法 | 第32-34页 |
| ·实验材料 | 第32页 |
| ·实验方法 | 第32-34页 |
| ·穿龙薯蓣总皂苷的提取 | 第32-33页 |
| ·主要甾体皂苷成分的分离纯化 | 第33页 |
| ·穿龙薯蓣中甾体皂苷成分的分析方法 | 第33-34页 |
| ·结果与讨论 | 第34-38页 |
| ·穿龙薯蓣总皂苷的提取及其主要甾体皂苷的分离纯化 | 第34-35页 |
| ·化合物1的结构鉴定 | 第35-37页 |
| ·化合物2的结构鉴定 | 第37-38页 |
| ·小结 | 第38-39页 |
| 第三章 穿龙薯蓣总皂苷的生物转化及其产物的分离鉴定 | 第39-55页 |
| ·引言 | 第39-40页 |
| ·材料与方法 | 第40-43页 |
| ·实验材料 | 第40页 |
| ·实验方法 | 第40-43页 |
| ·微生物产酶发酵方法以及粗酶液的制备 | 第40-41页 |
| ·产酶微生物的筛选 | 第41页 |
| ·发酵产酶条件的优化 | 第41页 |
| ·穿龙薯蓣总皂苷酶解反应条件的确定 | 第41-42页 |
| ·穿龙薯蓣总皂苷的批量酶解 | 第42页 |
| ·穿龙薯蓣总皂苷酶解产物的分离纯化 | 第42-43页 |
| ·结果与讨论 | 第43-54页 |
| ·产酶微生物的筛选 | 第43页 |
| ·米曲霉发酵粗酶液催化水解穿龙薯蓣总皂苷 | 第43-46页 |
| ·发酵产酶条件的优化 | 第46-48页 |
| ·发酵产酶培养时间的确定 | 第46页 |
| ·发酵产酶诱导物的确定 | 第46-47页 |
| ·发酵产酶诱导物浓度的确定 | 第47-48页 |
| ·酶反应条件的优化 | 第48-50页 |
| ·酶反应温度的确定 | 第48页 |
| ·酶反应pH的确定 | 第48-49页 |
| ·底物溶度和反应时间的确定 | 第49-50页 |
| ·酶解产物的批量制备以及分离纯化 | 第50-51页 |
| ·主要酶解产物的结构鉴定 | 第51-54页 |
| ·酶解产物薯蓣次皂苷A的NMR检测 | 第51-52页 |
| ·酶解产物纤细皂苷的NMR检测 | 第52-54页 |
| ·小结 | 第54-55页 |
| 第四章 原薯蓣皂苷糖苷酶的分离纯化及酶性质研究 | 第55-72页 |
| ·引言 | 第55页 |
| ·材料与方法 | 第55-59页 |
| ·实验材料 | 第55-56页 |
| ·实验方法 | 第56-59页 |
| ·酶的分离纯化 | 第56页 |
| ·酶活力的测定 | 第56页 |
| ·酶蛋白浓度的测定 | 第56-57页 |
| ·酶蛋白分子量及纯度的测定 | 第57页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶一般酶性质的研究 | 第57-59页 |
| ·结果与讨论 | 第59-71页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶的分离纯化 | 第59-63页 |
| ·凝胶分子筛层析分离酶蛋白 | 第59-60页 |
| ·离子交换层析第一次分离酶蛋白 | 第60-61页 |
| ·离子交换层析第二次分离酶蛋白 | 第61-62页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶纯度的鉴定 | 第62-63页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶分子量的测定 | 第63-65页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶酶性质的研究 | 第65-67页 |
| ·温度对酶活力的影响 | 第65页 |
| ·pH对酶活力的影响 | 第65-66页 |
| ·金属离子对酶活力的影响 | 第66-67页 |
| ·酶催化水解原薯蓣皂苷 | 第67-68页 |
| ·酶催化水解原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的反应动力学 | 第68-69页 |
| ·酶催化水解原薯蓣皂苷的反应动力学 | 第68-69页 |
| ·酶催化水解薯蓣皂苷的反应动力学 | 第69页 |
| ·酶催化水解剖pNP系列底物 | 第69-70页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶与其他甾体皂苷糖苷酶的比较 | 第70-71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 第五章 原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因的克隆 | 第72-89页 |
| ·引言 | 第72页 |
| ·材料与方法 | 第72-79页 |
| ·实验材料 | 第72页 |
| ·实验方法 | 第72-79页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型N-端序列的测定 | 第72-73页 |
| ·总RNA的提取和精制 | 第73页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因片段的获得 | 第73-74页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型3’端基因序列的获取 | 第74-76页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型5’端基因序列的获取 | 第76-77页 |
| ·3’RACE和5’RACE扩增序列的验证 | 第77-78页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因全长序列的生物信息学分析 | 第78页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因的克隆 | 第78-79页 |
| ·结果与讨论 | 第79-88页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型的N端序列的测定 | 第79页 |
| ·总RNA的提取 | 第79-80页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因全序列的获取 | 第80-84页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因片段的获取 | 第80-81页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型3’端基因序列的获取 | 第81-82页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型5’端基因序列的获取 | 第82-83页 |
| ·3’RACE和5’RACE扩增序列的验证 | 第83-84页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因序列的生物信息学分析 | 第84-87页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因序列分析 | 第84-86页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因序列相似性比较 | 第86-87页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因的克隆及鉴定 | 第87-88页 |
| ·小结 | 第88-89页 |
| 第六章 原薯蓣皂苷糖苷酶-1型的异源表达 | 第89-100页 |
| ·引言 | 第89页 |
| ·材料与方法 | 第89-92页 |
| ·实验材料 | 第89页 |
| ·培养基 | 第89页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型重组毕赤酵母菌株的构建 | 第89-91页 |
| ·真核重组表达载体的构建 | 第89-90页 |
| ·真核重组表达载体的线性化 | 第90页 |
| ·GS115感受态细胞的制备及电转化 | 第90-91页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第91页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型基因在毕赤酵母中的诱导表达 | 第91-92页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第91-92页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导培养 | 第92页 |
| ·结果与讨论 | 第92-99页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型重组毕赤酵母菌株的构建 | 第92-95页 |
| ·载体和目的基因片段的处理 | 第92-93页 |
| ·真核重组表达载体的构建及酶切鉴定 | 第93页 |
| ·真核重组表达载体的线性化 | 第93-94页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第94-95页 |
| ·原薯蓣皂苷糖苷酶-1型在毕赤酵母中的诱导表达 | 第95-99页 |
| ·重组酵母菌诱导表达蛋白浓度的测定 | 第95-96页 |
| ·重组酵母菌诱导产酶的最佳培养时间 | 第96页 |
| ·重组酵母菌诱导产酶的最佳甲醇诱导浓度 | 第96-97页 |
| ·诱导表达酶催化水解原薯蓣皂苷 | 第97-98页 |
| ·诱导表达酶蛋白的SDS-PAGE检测 | 第98-99页 |
| ·小结 | 第99-100页 |
| 第七章 结论 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第115页 |
| 攻读博士期间参与发表的发明专利 | 第115-116页 |
| 附录 | 第116-147页 |
| 附录A 原薯蓣皂苷的NMR检测图谱 | 第116-124页 |
| 附录B 薯蓣皂苷的NMR检测图谱 | 第124-132页 |
| 附录C 薯蓣次皂苷A的NMR检测图谱 | 第132-140页 |
| 附录D 纤细皂苷的NMR检测图谱 | 第140-147页 |
