| 摘要 | 第1-3页 |
| ABSTRACT | 第3-10页 |
| 综述 | 第10-20页 |
| 1. 弓形虫速殖子的主要表面抗原 | 第10-13页 |
| ·P30基因(SAG1) | 第10-11页 |
| ·P22基因(SAG2) | 第11-12页 |
| ·P43基因(SAG3) | 第12-13页 |
| ·P35抗原基因 | 第13页 |
| 2. 弓形虫的诊断情况 | 第13-14页 |
| 参考文献 | 第14-20页 |
| 符号说明 | 第20-22页 |
| 前言 | 第22-24页 |
| 参考文献 | 第23-24页 |
| 第一部分 SAG1基因片段的克隆及重组质粒的鉴定 | 第24-38页 |
| 1. 材料 | 第24-27页 |
| ·质粒、菌株 | 第24页 |
| ·试剂与设备 | 第24页 |
| ·DNA测序 | 第24-25页 |
| ·引物合成 | 第25页 |
| ·主要仪器设备 | 第25页 |
| ·主要试剂配方 | 第25-27页 |
| 1) 琼脂糖电泳所需试剂 | 第25页 |
| (1) 溴化乙锭(10mg/mL) | 第25页 |
| (2) EDTA(0.5mol/L) | 第25页 |
| (3) 50xTAE电泳缓冲液,工作液为1× | 第25页 |
| (4) 0.7 %琼脂糖凝胶 | 第25页 |
| 2) 细菌培养基及抗生素 | 第25-26页 |
| (1) LB培养基液体 | 第25-26页 |
| (2) LB固体培养基 | 第26页 |
| (3) 氨苄青霉素(储液浓度100mg/mL) | 第26页 |
| 3) 感受态制备所需试剂 | 第26-27页 |
| (1) CaCl_2(1mol/L) | 第26页 |
| (2) CaCl_2(0.1mol/L) | 第26页 |
| (3) 氯化钙/氯化镁储存液(0.1mmol/L) | 第26页 |
| (4) PBS | 第26-27页 |
| 2. 方法 | 第27-33页 |
| ·pCold-TF/SAG1重组质粒的构建 | 第27-30页 |
| ·目的重组质粒的转化 | 第30-31页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第31-33页 |
| 3. 结果 | 第33-35页 |
| ·原核表达载体pCold-TF/SAG1的鉴定 | 第33-34页 |
| ·重组质粒测序 | 第34页 |
| ·目的氨基酸序列的抗原性预测 | 第34-35页 |
| 4. 讨论 | 第35-36页 |
| 参考文献 | 第36-38页 |
| 第二部分 重组蛋白的表达及鉴定 | 第38-57页 |
| 1. 材料 | 第38-42页 |
| ·生物材料及来源 | 第38页 |
| ·生化试剂及部分配制方法 | 第38-42页 |
| 1) SDS-PAGE电泳所需试剂 | 第38-39页 |
| (1) 2×SDS裂解液 | 第38页 |
| (2) 1.5 mol/L Tris·HCL(pH8.8) | 第38页 |
| (3) 0.5 mol/L Tris·HCl(pH6.8) | 第38页 |
| (4) 10%SDS | 第38页 |
| (5) 10%过硫酸铵 | 第38-39页 |
| (6) 30%Acr/Bis | 第39页 |
| (7) 1×Tris-甘氨酸缓冲液(Running buffer) | 第39页 |
| (8) 考马斯亮蓝染色液 | 第39页 |
| (9) 脱色液 | 第39页 |
| (10) 7M尿素 | 第39页 |
| 2) Ni-NTA纯化所需试剂 | 第39-40页 |
| (1) IMAC lysis buffer,pH8.0 | 第39-40页 |
| (2) 1MAC wash buffer1,pH8.0 | 第40页 |
| (3) IMAC wash buffer2,pH8.0 | 第40页 |
| (4) IMAC elution buffer,pH8.0 | 第40页 |
| (5) Cleaning solution1,pH8.0 | 第40页 |
| (6) Cleaning solution2,pH4.5 | 第40页 |
| (7) Storage solution | 第40页 |
| 3) ELISA所需试剂 | 第40-41页 |
| (1) PBST(pH7.4) | 第40页 |
| (2) 封闭液 | 第40页 |
| (3) 稀释液 | 第40页 |
| (4) A液(pH5.0,磷酸盐-柠檬酸缓冲液) | 第40-41页 |
| (5) B液(使用液) | 第41页 |
| (6) 底物缓冲液 | 第41页 |
| (7) 终止液(2MH_2SO_4) | 第41页 |
| (8) 包被缓冲液 | 第41页 |
| 4) Western所用试剂 | 第41-42页 |
| (1) 电转缓冲液(Trans buffer) | 第41页 |
| (2) 封闭液 | 第41页 |
| (3) 抗体稀释液 | 第41页 |
| (4) PVDF膜 | 第41-42页 |
| (5) 预染蛋白Maker | 第42页 |
| 5) 所需抗体 | 第42页 |
| ·主要仪器设备 | 第42页 |
| ·试剂盒 | 第42页 |
| 2. 方法 | 第42-48页 |
| ·重组质粒转化入表达宿主菌 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的诱导表达 | 第43-44页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第44页 |
| ·蛋白表达产物的定位 | 第44-45页 |
| ·表达产物IMAC Ni-NTA柱纯化 | 第45页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第45页 |
| ·间接ELISA法检测SAG1/TF蛋白活性 | 第45-46页 |
| ·Western Blot检测TF/SAG1蛋白 | 第46-47页 |
| ·金标法检测TF/SAG1重组蛋白 | 第47-48页 |
| 3. 结果 | 第48-54页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第48-49页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第49-50页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测 | 第50-51页 |
| ·TF/SAG1和TF蛋白的活性试验 | 第51-53页 |
| ·TF/SAG1 Western Blot结果 | 第53页 |
| ·金标法检测TF/SAG1蛋白 | 第53-54页 |
| 4. 讨论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-57页 |
| 第三部分 重组蛋白的初步应用 | 第57-60页 |
| 1. 标本材料 | 第57页 |
| 2. 方法 | 第57-58页 |
| 3. 结果 | 第58页 |
| 4. 讨论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
