| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 缩略词表 | 第12-13页 |
| 目录 | 第13-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-25页 |
| 1 前沿 | 第16-17页 |
| 2 基因治疗的病毒载体简介 | 第17-19页 |
| ·逆转录病毒 | 第17页 |
| ·慢病毒 | 第17页 |
| ·腺病毒 | 第17-18页 |
| ·单纯疱疹病毒载体 | 第18页 |
| ·腺相关病毒载体 | 第18-19页 |
| 3 腺相关病毒的生物学简介 | 第19-20页 |
| 4 DNA shuffling 在 AAV 载体改组的原理及应用发展 | 第20-22页 |
| 5 鼻咽癌治疗的现状及发展 | 第22-23页 |
| 6 AAV 载体在肿瘤基因治疗中的应用 | 第23-24页 |
| ·AAV 介导的抗血管生基因治疗 | 第23页 |
| ·AAV 介导的自杀基因治疗 | 第23页 |
| ·AAV 介导的免疫基因治疗 | 第23-24页 |
| ·AAV 介导的联合治疗 | 第24页 |
| 7 本科题的研究内容及创新点 | 第24-25页 |
| ·本课题的研究内容 | 第24页 |
| ·本课题的创新点 | 第24-25页 |
| 第二章 pARC 载体克隆库的构建 | 第25-59页 |
| 1 前言 | 第25页 |
| 2 实验器材 | 第25-28页 |
| ·主要实验材料 | 第25页 |
| ·主要实验仪器 | 第25-26页 |
| ·主要实验试剂 | 第26-27页 |
| ·主要试剂的配置方法 | 第27-28页 |
| ·引物合成 | 第28页 |
| 3 实验方法 | 第28-42页 |
| ·AAV1-9 cap 片段序列的获得 | 第28-31页 |
| ·AAV 衣壳的 DnaseⅠ酶切 | 第31页 |
| ·AAV 衣壳的 DNA shuffling 技术探索 | 第31-38页 |
| ·AAV 衣壳 DNA shuffling 产物回收 | 第38-39页 |
| ·构建 pAdB-rc 克隆库 | 第39-42页 |
| 4 结果 | 第42-58页 |
| ·各原始型 AAV 的 cap 片段序列电泳结果 | 第42-43页 |
| ·原始型 AAV cap 片段序列经 Dnase Ⅰ酶切后的电泳结果 | 第43页 |
| ·AAV 衣壳的 DNA shuffling 技术探索结果 | 第43-56页 |
| ·重组后目的片段和非特异性拖带电泳结果 | 第56-57页 |
| ·构建 pAdB-rc 克隆库 | 第57-58页 |
| 5 讨论 | 第58-59页 |
| 第三章 细胞培养及嵌合 AAV 的筛选 | 第59-72页 |
| 1 前言 | 第59页 |
| 2 实验器材 | 第59-60页 |
| ·实验所需材料及试剂 | 第59页 |
| ·实验所需仪器 | 第59-60页 |
| ·主要试剂的配制 | 第60页 |
| 3 实验方法 | 第60-67页 |
| ·HEK293 细胞复苏和传代 | 第60-61页 |
| ·CNE-3 细胞的复苏和传代 | 第61-62页 |
| ·pAdB-rc 质粒转染 HEK293 细胞 | 第62-63页 |
| ·测浓缩嵌合 AAV 的滴度 | 第63-64页 |
| ·嵌合 AAV 的筛选 | 第64-65页 |
| ·PCR 检测筛选到的嵌合 AAV(cAAV) | 第65-67页 |
| 4 实验结果 | 第67-71页 |
| ·嵌合型 AAV 病毒文库基因组滴度检测的结果 | 第67-68页 |
| ·确定 Ad35-EGFP 感染时间和 MOI 值的荧光结果 | 第68-70页 |
| ·嵌合 AAV 文库筛选 CNE-3 鼻咽癌细胞时的荧光结果 | 第70-71页 |
| ·四轮筛选 cAAV 的 PCR 检测 | 第71页 |
| 5 讨论 | 第71-72页 |
| 第四章 cAAV 感染活性的检测 | 第72-90页 |
| 1 前言 | 第72页 |
| 2 实验器材 | 第72-75页 |
| ·实验所需材料 | 第72页 |
| ·实验所需仪器 | 第72-73页 |
| ·实验所需主要试剂 | 第73-74页 |
| ·主要试剂的配制 | 第74-75页 |
| 3 实验方法 | 第75-81页 |
| ·分离嵌合型 AAV 病毒 | 第75-78页 |
| ·每种原始型 AAV 以及 cpAdB-rc 与 pAAV-EGFP 重组包装 AAV-EGFP | 第78页 |
| ·重组病毒 AAV-EGFP 的 RT-PCR 检测 | 第78-79页 |
| ·cAAV-EGFP 感染活性的检测 | 第79-80页 |
| ·cAAV-EGFP 靶向性的检测 | 第80-81页 |
| 4 实验结果 | 第81-89页 |
| ·cAAV 病毒 DNA 和载体 pAdBⅡ的酶切鉴定结果 | 第81页 |
| ·cpAdB-rc 克隆鉴结果 | 第81-82页 |
| ·cAAV 与 qAAV-EGFP 重组的荧光结果 | 第82-83页 |
| ·cAAV 测序结果 | 第83页 |
| ·各种重组 AAV 病毒的 RT-PCR 检测 | 第83-86页 |
| ·cAAV-EGFP 感染性的检测 | 第86-87页 |
| ·cAAV 与 qAAV-EGFP 靶向性的检测 | 第87-89页 |
| 5、讨论 | 第89-90页 |
| 总结 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-96页 |
| 致谢 | 第96页 |
