| 目录 | 第1-6页 |
| 中文摘要 | 第6-7页 |
| 英文摘要 | 第7-8页 |
| 前言 | 第8-19页 |
| 1 线粒体是一具双层膜的、半自主细胞器 | 第8-9页 |
| 2 线粒体的基本功能 | 第9-11页 |
| ·线粒体氧化磷酸化 | 第9-10页 |
| ·活性氧的产生 | 第10-11页 |
| 3 线粒体基因组的唯一调控区介导线粒体DNA的转录复制 | 第11-16页 |
| ·类核体是线粒体的“染色体” | 第11-13页 |
| ·线粒体DNA的复制 | 第13页 |
| ·线粒体DNA的转录调节及其相关转录因子 | 第13-16页 |
| ·线粒体DNA的编码产物及其转录调节 | 第13-15页 |
| ·线粒体RNA聚合酶POLRMT | 第15页 |
| ·线粒体转录因子A(TFAM) | 第15-16页 |
| ·线粒体转录因子TFB1M和TFB2M | 第16页 |
| 4 线粒体内膜蛋白-Mitofilin | 第16-17页 |
| 5 本研究的主要研究内容 | 第17-19页 |
| 材料与方法 | 第19-39页 |
| 1 材料 | 第19-21页 |
| ·菌株与质粒 | 第19页 |
| ·细胞系及实验用小鼠 | 第19页 |
| ·限制性内切酶和主要的工具酶 | 第19页 |
| ·抗体 | 第19-20页 |
| ·其他主要试剂及材料 | 第20页 |
| ·主要仪器设备 | 第20-21页 |
| 2. 实验方法 | 第21-39页 |
| ·基本技术路线 | 第21页 |
| ·细菌操作与质粒的转化 | 第21-23页 |
| ·感受态大肠杆菌DH5-α制备 | 第21页 |
| ·质粒的转化 | 第21-22页 |
| ·质粒的提取和纯化 | 第22-23页 |
| ·细胞培养 | 第23-24页 |
| ·细胞培养 | 第23页 |
| ·细胞的传代 | 第23页 |
| ·细胞的复苏及冻存 | 第23-24页 |
| ·非病毒方法介导的哺乳动物细胞转染 | 第24页 |
| ·转染用质粒DNA的大量制备 | 第24页 |
| ·阳离子转染试剂转染细胞 | 第24页 |
| ·逆转录病毒的包装和靶细胞的感染 | 第24-26页 |
| ·半定量RT-PCR | 第26-27页 |
| ·总RNA的提取 | 第26页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第26页 |
| ·RT-PCR检测 | 第26-27页 |
| ·Realtime PCR检测 | 第27页 |
| ·Western blot和蛋白质相互作用实验 | 第27-33页 |
| ·Western blot分析蛋白水平的变化 | 第27-30页 |
| ·蛋白质免疫共沉淀 | 第30-31页 |
| ·蛋白质体外相互作用—GST pull down | 第31-33页 |
| ·线粒体DNA免疫沉淀(mIP)分析 | 第33-36页 |
| ·细胞培养 | 第33-34页 |
| ·细胞固定 | 第34页 |
| ·细胞的裂解与超声处理 | 第34页 |
| ·超声结果的分析 | 第34页 |
| ·免疫沉淀 | 第34-35页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第35页 |
| ·PCR反应 | 第35页 |
| ·mIP实验中所用的各种溶液 | 第35-36页 |
| ·EMSA | 第36-38页 |
| ·核蛋白提取 | 第36-37页 |
| ·生物素标记探针 | 第37页 |
| ·PAGE电泳转膜 | 第37-38页 |
| ·杂交及显影 | 第38页 |
| ·溶液配制 | 第38页 |
| ·统计学分析 | 第38-39页 |
| 实验结果 | 第39-54页 |
| 1、Mitofilin与线粒体转录因子相互作用 | 第39-46页 |
| ·Mitofilin与TFAM相互作用 | 第39-40页 |
| ·Mitofilin与线粒体转录因子TFB1M和TFB2M相互作用 | 第40-41页 |
| ·MBP-pull down证明Mitofilin可直接与TFAM和TFB1M结合 | 第41-45页 |
| ·Mitofilin、TFAM和TFB1M/TFB2M重组蛋白的纯化 | 第44页 |
| ·Mitofilin与TFAM、TFB 1 M/TFB2M直接相互作用 | 第44-45页 |
| ·MBP-pull down进一步证明Mitofilin与TFAM的C-末端直接相互作用 | 第45-46页 |
| 2、mlp和EMSA证明TFAM的C末端缺失区可以结合于mtDNA的D-loop区 | 第46-49页 |
| ·mIP证明TFAM可以结合于mtDNA的D-loop区 | 第47-48页 |
| ·凝胶迁移率阻滞实验显示TFAM的C末端缺失区可以与mtDNA结合 | 第48-49页 |
| 3 Mitofilin的缺失减少TFAM在线粒体DNA D-loop区的结合 | 第49-51页 |
| ·干扰mitofilin的逆转录病毒的构建和表达 | 第49-51页 |
| ·mIP检测在mitofilin干扰的细胞中TFAM的与线粒体DNA的结合明显减弱 | 第51页 |
| 4、Mitofilin~(+/-)小鼠氧化磷酸化复合物活性较野生型降低 | 第51-54页 |
| ·Mitofilin~(+/-)小鼠中复合物Ⅰ、Ⅳ的表达降低 | 第52页 |
| ·体内外酶学实验发现复合物Ⅰ和复合物Ⅰ/Ⅲ的活性也有一定程度的下降 | 第52-54页 |
| 讨论 | 第54-58页 |
| 1 Mitofilin可募集转录起始复合物于mtDNA启动子区 | 第54-55页 |
| 2 Mitofilin是机体调节能量需求的重要因子 | 第55-56页 |
| 3 Mitofilin对线粒体DNA转录调节的生理意义 | 第56-57页 |
| 4 本研究的不足与展望 | 第57-58页 |
| 小结 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-62页 |
| 文献综述 | 第62-71页 |
| 参考文献 | 第68-71页 |
| 英文名词及缩写 | 第71-73页 |
| 致谢 | 第73-75页 |
| 个人简历 | 第75-76页 |
