| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-53页 |
| 1 酿酒酵母表达系统 | 第17-47页 |
| ·宿主菌株 | 第18-20页 |
| ·转化方法 | 第18-19页 |
| ·筛选营养缺陷型菌株 | 第19页 |
| ·降低蛋白酶表达水平 | 第19页 |
| ·破坏同型启动子 | 第19页 |
| ·筛选强分泌型突变菌株 | 第19-20页 |
| ·表达载体 | 第20-30页 |
| ·表达载体的种类 | 第20-21页 |
| ·选择性标记 | 第21-24页 |
| ·启动子与终止子 | 第24-28页 |
| ·蛋白定位信号及亲和标签 | 第28-30页 |
| ·影响胞内表达的因素 | 第30-37页 |
| ·转录起始 | 第30-31页 |
| ·RNA延伸 | 第31页 |
| ·RNA稳定性 | 第31-32页 |
| ·翻译起始 | 第32-33页 |
| ·多肽延伸 | 第33-34页 |
| ·多肽折叠 | 第34-35页 |
| ·翻译后加工 | 第35-36页 |
| ·蛋白本身的稳定性 | 第36-37页 |
| ·影响分泌表达的因素 | 第37-43页 |
| ·载体和信号序列 | 第38-40页 |
| ·糖基化 | 第40-41页 |
| ·蛋白折叠与转运 | 第41-42页 |
| ·蛋白前体加工 | 第42-43页 |
| ·提高分泌效率的策略 | 第43页 |
| ·外源基因表达的生理特点 | 第43-47页 |
| ·毒性机理 | 第44页 |
| ·低表达量变异的产生 | 第44-45页 |
| ·大规模发酵及其优化 | 第45-47页 |
| 2 燃料酒精的研究进展 | 第47-51页 |
| ·生产酒精的微生物 | 第47-48页 |
| ·生产酒精的原料 | 第48-49页 |
| ·生产酒精的技术和工艺 | 第49-51页 |
| 3 本论文研究背景、内容及意义 | 第51-53页 |
| 第二章 高产酒精酵母菌尿嘧啶缺陷型的获得及表达载体构建 | 第53-89页 |
| 第一节 构建酿酒酵母W0菌株尿嘧啶缺陷型菌株 | 第54-77页 |
| 0 前言 | 第54-55页 |
| 1 材料 | 第55-58页 |
| ·试剂 | 第55-57页 |
| ·培养基 | 第57-58页 |
| ·菌株和质粒 | 第58页 |
| 2 方法 | 第58-68页 |
| ·引物的设计 | 第59-61页 |
| ·PCR模板的制备 | 第61页 |
| ·PCR反应体系及条件 | 第61-62页 |
| ·PCR产物的回收 | 第62页 |
| ·纯化的PCR产物磷酸化 | 第62页 |
| ·磷酸化产物与载体连接 | 第62-63页 |
| ·大肠杆菌DH5α转化 | 第63页 |
| ·质粒提取 | 第63页 |
| ·阳性克隆的验证 | 第63页 |
| ·酶切消化 | 第63-64页 |
| ·单链DNA退火 | 第64-65页 |
| ·W0对抗生素敏感性 | 第65页 |
| ·DNA片段连接 | 第65页 |
| ·酵母转化 | 第65-66页 |
| ·敲除转化子检测 | 第66-67页 |
| ·转化子产孢及孢子萌发 | 第67页 |
| ·潮霉素B抗性标记的删除 | 第67-68页 |
| ·尿嘧啶缺陷型验证 | 第68页 |
| ·细胞干重的测定 | 第68页 |
| 3 结果与分析 | 第68-75页 |
| ·URA3、hptⅡ基因表达框的克隆 | 第68-69页 |
| ·URA3敲除载体构建 | 第69-70页 |
| ·W0菌株URA3基因敲除 | 第70-73页 |
| ·抗性基因表达框的删除 | 第73-74页 |
| ·尿嘧啶缺陷型与原养型比较 | 第74页 |
| ·验证缺陷型与URA3基因互补性 | 第74-75页 |
| 4 讨论 | 第75-77页 |
| 第二节 构建rDNA多位点整合型表达载体 | 第77-88页 |
| 0 前言 | 第77-79页 |
| 1 材料 | 第79页 |
| ·试剂和培养基 | 第79页 |
| ·菌株和质粒 | 第79页 |
| 2 方法 | 第79-83页 |
| ·PCR引物的设计 | 第80-81页 |
| ·PCR反应体系及条件 | 第81-83页 |
| ·酶切消化 | 第83页 |
| ·实验中使用的其它方法 | 第83页 |
| 3 结果与分析 | 第83-87页 |
| ·rDNA整合片段的克隆 | 第83-85页 |
| ·URA3d-PMT片段的克隆 | 第85-86页 |
| ·表达载体的构建 | 第86-87页 |
| ·表达载体的验证 | 第87页 |
| 4 讨论 | 第87-88页 |
| 本章小结 | 第88-89页 |
| 第三章 构建可利用菊粉的高产酒精酿酒酵母工程菌株 | 第89-125页 |
| 第一节 季也蒙毕赤酵母菊粉酶基因INU1在酿酒酵母W12d中整合表达 | 第92-108页 |
| 0 前言 | 第92-93页 |
| 1 材料 | 第93页 |
| ·试剂和培养基 | 第93页 |
| ·菌株和质粒 | 第93页 |
| 2 方法 | 第93-97页 |
| ·引物的设计 | 第93-94页 |
| ·PCR反应体系及条件 | 第94页 |
| ·酶切消化 | 第94-95页 |
| ·酵母转化 | 第95页 |
| ·重组子培养条件 | 第95页 |
| ·重组菊粉酶粗酶液的制备 | 第95页 |
| ·重组菊粉酶活性的测定 | 第95-96页 |
| ·细胞干重的测定 | 第96页 |
| ·最佳加酶量和发酵时间的确定 | 第96页 |
| ·酒精蒸馏和酒精含量的测定 | 第96页 |
| ·还原糖和总糖的测定 | 第96页 |
| ·5-L发酵罐一步法发酵生产酒精 | 第96-97页 |
| ·重组子产酶稳定性 | 第97页 |
| ·实验中使用的其它方法 | 第97页 |
| 3 结果与分析 | 第97-106页 |
| ·菊粉酶基因INU1表达质粒的构建 | 第97-98页 |
| ·菊粉酶基因INU1在酿酒酵母中表达 | 第98-99页 |
| ·测定转子酶活 | 第99-100页 |
| ·重组酶分布 | 第100-101页 |
| ·产酶与细胞生长的关系 | 第101-102页 |
| ·产酶稳定性 | 第102-103页 |
| ·最佳加酶量和最佳发酵时间 | 第103-104页 |
| ·1-L体系同步糖化菊粉生产酒精 | 第104-105页 |
| ·5-L发酵罐同步糖化菊粉生产酒精 | 第105-106页 |
| 4 讨论 | 第106-108页 |
| 第二节 季也蒙毕赤酵母菊粉酶基因的改造及高效表达 | 第108-124页 |
| 0 前言 | 第108-109页 |
| 1 材料 | 第109页 |
| ·试剂和培养基 | 第109页 |
| ·菌株与质粒 | 第109页 |
| 2 方法 | 第109-113页 |
| ·引物的设计 | 第109页 |
| ·PCR反应体系及条件 | 第109-112页 |
| ·酶切消化 | 第112-113页 |
| ·改造过的菊粉酶基因与原始基因表达量对比 | 第113页 |
| ·实验中使用的其它方法 | 第113页 |
| 3 结果与分析 | 第113-123页 |
| ·rDNA整合载体的改造 | 第113-115页 |
| ·δ序列整合型载体的构建 | 第115-116页 |
| ·定点突变INU1基因 | 第116-118页 |
| ·改造的菊粉酶基因表达质粒的构建 | 第118-119页 |
| ·改造的菊粉酶基因在酿酒酵母表达 | 第119-121页 |
| ·产酶与细胞生长的关系 | 第121页 |
| ·转化子R27在产酒精中的应用 | 第121-123页 |
| 4 讨论 | 第123-124页 |
| 本章小结 | 第124-125页 |
| 第四章 构建可利用淀粉的高产酒精酿酒酵母工程菌株 | 第125-141页 |
| 1 材料 | 第127-128页 |
| ·试剂和培养基 | 第127-128页 |
| ·菌株和质粒 | 第128页 |
| 2 方法 | 第128-134页 |
| ·引物的设计 | 第128-131页 |
| ·PCR反应体系及条件 | 第131页 |
| ·酶切消化 | 第131-132页 |
| ·酵母转化 | 第132页 |
| ·淀粉酶粗酶液的制备 | 第132页 |
| ·淀粉酶总活性的测定 | 第132页 |
| ·α-淀粉酶活性的测定 | 第132-133页 |
| ·葡萄糖淀粉酶活性的测定 | 第133页 |
| ·最佳加酶量和最佳发酵时间的确定 | 第133页 |
| ·2-L发酵罐糖化木薯淀粉发酵酒精 | 第133页 |
| ·实验中使用的其它方法 | 第133-134页 |
| 3 结果与分析 | 第134-139页 |
| ·ALP1、GLM基因的克隆 | 第134-135页 |
| ·表达质粒的构建 | 第135页 |
| ·淀粉酶基因在酿酒酵母中表达 | 第135-136页 |
| ·转化子淀粉酶活性 | 第136-137页 |
| ·AMY-39同步糖化木薯淀粉生产酒精 | 第137-139页 |
| 4 讨论 | 第139-140页 |
| 本章小结 | 第140-141页 |
| 总结与创新点 | 第141-143页 |
| 参考文献 | 第143-162页 |
| 附录 | 第162-176页 |
| 个人简历 | 第176页 |
| 发表的学术论文 | 第176-177页 |
| 致谢 | 第177页 |