| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-15页 |
| 本论文的缩写词汇表 | 第15-17页 |
| 本研究所用的主要仪器设备 | 第17-19页 |
| 第一章 绪论 | 第19-34页 |
| ·生物的分类、起源与进化 | 第19-20页 |
| ·极端环境微生物的研究现状 | 第20-21页 |
| ·几丁质降解途径的研究 | 第21-25页 |
| ·几丁质降解途径的比较 | 第21-24页 |
| ·古菌中与几丁质降解有关的嗜热酶 | 第24-25页 |
| ·几丁质酶 | 第24-25页 |
| ·外切氨基葡萄糖苷酶 | 第25页 |
| ·几丁二糖脱乙酰酶 | 第25页 |
| ·糖苷水解酶催化机制研究综述 | 第25-29页 |
| ·糖苷水解酶的分类 | 第25-27页 |
| ·糖苷水解酶催化机制及鉴定 | 第27-29页 |
| ·嗜热酶的热稳定机制 | 第29-30页 |
| ·嗜热古菌特有的糖酵解途径(ED glycolysis pathway) | 第30-34页 |
| 第二章 超嗜热古菌PyFococcus horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶的研究 | 第34-62页 |
| ·材料与方法 | 第35-45页 |
| ·菌株与质粒 | 第35页 |
| ·试剂 | 第35页 |
| ·主要仪器设备 | 第35页 |
| ·培养基和培养条件 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌DH5α与BL21-CodonPlus (DE3)-RIL感受细胞的制备 | 第36页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶(BglA_(ph))基因的克隆 | 第36-38页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第38页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶的活性检测 | 第38-39页 |
| ·酶动力学分析 | 第39-40页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶的底物特异性及水解产物分析 | 第40-41页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶的底物特异性研究 | 第41页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶酶学性质 | 第41页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶对温度及pH的依赖性 | 第41页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶的热稳定性及pH稳定性 | 第41页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶对变性剂抗性的研究 | 第41-42页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶蛋白结构的研究 | 第42页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶突变蛋白的构建与催化机制的研究 | 第42-45页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶关键催化氨基酸点突变蛋白的构建 | 第42-43页 |
| ·突变蛋白功能的鉴定 | 第43-45页 |
| ·pH对E181A催化活性的影响 | 第43-44页 |
| ·叠氮钠与甲酸钠对E349A活性的影响 | 第44-45页 |
| ·叠氮钠对E349A催化活性恢复的影响 | 第44页 |
| ·甲酸钠对E349A催化活性的影响 | 第44-45页 |
| ·P.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶缺失突变蛋白的构建 | 第45页 |
| ·结果与分析 | 第45-59页 |
| ·1.horikoshii OT3外切氨基葡萄糖苷酶基因序列与蛋白序列分析 | 第45-50页 |
| ·BglA_(ph)的基因克隆、表达与纯化 | 第50-52页 |
| ·BglA_(ph)的底物特异性及水解模式 | 第52-54页 |
| ·BglA_(ph)的酶学性质分析 | 第54-56页 |
| ·BglA_(ph)的最适温度与最适pH | 第54-55页 |
| ·BglA_(ph)的热稳定性与pH稳定性 | 第55-56页 |
| ·BglA_(ph)对变性剂或添加剂的抗性 | 第56页 |
| ·BglA_(ph)的蛋白结构分析 | 第56-57页 |
| ·BglA_(ph)催化机制的探讨 | 第57-58页 |
| ·BglA_(ph)的热稳定机制的探讨 | 第58-59页 |
| ·讨论 | 第59-62页 |
| ·BglA_(ph)的酶学性质与应用 | 第59-60页 |
| ·BglA_(ph)的生理功能 | 第60页 |
| ·BglA_(ph)的催化机制 | 第60页 |
| ·BglA_(ph)的热稳定机制 | 第60-62页 |
| 第三章 超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3几丁二糖脱乙酰酶的研究 | 第62-71页 |
| ·材料与方法 | 第62-64页 |
| ·材料 | 第62页 |
| ·PCR引物设计及扩增反应 | 第62页 |
| ·基因的诱导表达与蛋白质的纯化 | 第62-63页 |
| ·Dac_(ph)的酶活检测 | 第63页 |
| ·Dac_(ph)的最适反应温度与最适pH | 第63-64页 |
| ·结果与分析 | 第64-69页 |
| ·Dac_(ph)序列分析 | 第64-65页 |
| ·基因的扩增和表达质粒pET15b-Dac_(ph)的构建 | 第65-66页 |
| ·重组蛋白的表达与纯化 | 第66页 |
| ·Dac_(ph)的酶性质鉴定 | 第66-68页 |
| ·Dac_(ph)的最适反应温度与最适pH | 第68-69页 |
| ·讨论 | 第69-71页 |
| ·Dac_(ph)的诱导表达条件 | 第69页 |
| ·Dac_(ph)的酶学性质与生长温度 | 第69-70页 |
| ·Dac_(ph)的序列特征催化机制 | 第70页 |
| ·Dac_(ph)参与P.horikoshii几丁质代谢途径 | 第70-71页 |
| 第四章 超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3甘油酸激酶的研究 | 第71-93页 |
| ·材料与方法 | 第72-77页 |
| ·材料 | 第72页 |
| ·主要仪器 | 第72-73页 |
| ·PCR引物设计及扩增反应 | 第73页 |
| ·基因的诱导表达与蛋白质的纯化 | 第73-74页 |
| ·GK_(ph)的活性检测与产物分析 | 第74-75页 |
| ·方法1 | 第74页 |
| ·方法2 | 第74页 |
| ·方法3 | 第74-75页 |
| ·反应产物分析 | 第75页 |
| ·GK_(ph)的酶学性质 | 第75-76页 |
| ·GK_(ph)对温度及pH的依赖性 | 第75-76页 |
| ·GK_(ph)的热稳定性 | 第76页 |
| ·GK_(ph)的底物特异性 | 第76页 |
| ·单价金属离子、各种添加剂对GK_(ph)活力的影响 | 第76-77页 |
| ·动力学分析 | 第77页 |
| ·结果与分析 | 第77-90页 |
| ·GK_(ph)基因与氨基酸序列以及结构分析 | 第77-81页 |
| ·GK_(ph)的基因克隆、表达与纯化 | 第81-84页 |
| ·GK_(ph)酶学性质研究 | 第84-86页 |
| ·GK_(ph)的酶活性分析 | 第84-85页 |
| ·GK_(ph)的最适温度与pH | 第85-86页 |
| ·GK_(ph)的热稳定性 | 第86页 |
| ·GK_(ph)的底物特异性 | 第86-87页 |
| ·单价金属离子及添加剂对GK_(ph)活性的影响 | 第87-88页 |
| ·动力学性质 | 第88-90页 |
| ·讨论 | 第90-93页 |
| ·GK_(ph)独特的酶学性质与应用 | 第90页 |
| ·GK_(ph)的生理功能 | 第90-93页 |
| 第五章 超嗜热古菌Pyrococcus furiosus几丁质内切、外切酶与嗜热球古菌Pyrococcus属的特有几丁质降解途径 | 第93-103页 |
| ·材料与方法 | 第93-95页 |
| ·材料 | 第93页 |
| ·培养基和培养条件 | 第93页 |
| ·PCR引物设计、扩增反应以及重组质粒的构建 | 第93-94页 |
| ·几丁质内切、外切酶的表达纯化 | 第94-95页 |
| ·几丁质内切、外切酶水解模式的研究 | 第95页 |
| ·结果与分析 | 第95-101页 |
| ·P.furiosus几丁质酶序列分析 | 第95-96页 |
| ·P.furiosus几丁质内切酶基因(PF1234)与外切酶基因(PF1233)的克隆 | 第96-97页 |
| ·P.furiosus几丁质内切酶与几丁质外切酶的表达与纯化 | 第97-98页 |
| ·几丁质内切、外切酶的活性鉴定与水解模式 | 第98-101页 |
| ·讨论 | 第101-103页 |
| ·P.furiosus几丁质内切酶的诱导表达 | 第101页 |
| ·P.furiosus几丁质外切酶的诱导表达 | 第101-102页 |
| ·嗜热球古菌Pyrococcus属的特有几丁质降解途径 | 第102-103页 |
| 结论 | 第103-105页 |
| 1.Pyrococcus harikoshii OT3外切氨基糖苷酶的研究 | 第103页 |
| 2.P.horikoshii OT3甘油酸激酶(生成2-磷酸甘油酸)的研究 | 第103页 |
| 3.P.horikoshii OT3几丁二糖脱乙酰酶的研究 | 第103-104页 |
| 4.P.furiosus 几丁质内切酶和外切酶的研究 | 第104页 |
| 5.嗜热球古菌Pyrococcus属的特有几丁质降解途径 | 第104-105页 |
| 展望 | 第105-107页 |
| 1.参与嗜热球古菌几丁质降解的其他保守ORF的功能的鉴定 | 第105页 |
| 2.古菌特有的糖苷水解酶的催化机制与嗜热酶的热稳定机制 | 第105页 |
| 3.P.horikoshii 甘油酸激酶的功能与古菌特有的非磷酸糖酵解途径 | 第105-107页 |
| 参考文献 | 第107-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 攻读博士期间发表的文章与成果 | 第115-116页 |
| 附录 | 第116-133页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第133页 |
