| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-36页 |
| 1 动物脂肪组织的形成机理 | 第19-23页 |
| ·脂肪细胞的决定与分化 | 第19-21页 |
| ·脂肪的沉积与动员 | 第21-23页 |
| ·脂滴的形成 | 第21-22页 |
| ·参与的调控网络 | 第22-23页 |
| ·异常的沉积或动员 | 第23页 |
| 2 脂肪沉积相关候选基因的研究进展 | 第23-34页 |
| ·脂肪甘油三酯脂肪酶基因(adipose triglyceride lipase,ATGL) | 第23-28页 |
| ·ATGL的发现过程 | 第23-24页 |
| ·ATGL的分子结构 | 第24页 |
| ·ATGL的脂肪酶功能 | 第24-25页 |
| ·ATGL的表达规律 | 第25-26页 |
| ·ATGL的调控模式 | 第26-27页 |
| ·ATGL的应用前景 | 第27-28页 |
| ·脂联素基因(Adiponectin,Acrp30) | 第28-32页 |
| ·脂联素基因的分子生物学特征 | 第28-29页 |
| ·脂联素的生物学结构 | 第29-30页 |
| ·脂联素的生物学功能 | 第30-31页 |
| ·脂联素的调控 | 第31页 |
| ·应用前景 | 第31-32页 |
| ·抵抗素基因(Resistin,RSTN) | 第32-34页 |
| ·抵抗素的分子生物学特征 | 第32-33页 |
| ·抵抗素和肥胖 | 第33页 |
| ·抵抗素的表达调控 | 第33-34页 |
| ·猪抵抗素的研究进展 | 第34页 |
| 3 研究目的与意义 | 第34-36页 |
| 第二章 猪ATGL基因的分子生物学研究 | 第36-97页 |
| 1 引言 | 第36页 |
| 2 试验材料 | 第36-43页 |
| ·猪组织样品 | 第36页 |
| ·猪DNA样品 | 第36-37页 |
| ·猪血液样品 | 第36页 |
| ·猪辐射杂种克隆板(IMpRH) | 第36-37页 |
| ·质粒、菌种和细胞 | 第37-39页 |
| ·引物设计与合成 | 第39-40页 |
| ·主要仪器设备和器皿 | 第40-41页 |
| ·主要药品及试剂 | 第41页 |
| ·缓冲液及常用试剂的配制 | 第41-42页 |
| ·主要生物学软件 | 第42-43页 |
| 3 试验方法 | 第43-60页 |
| ·猪组织总RNA的提取 | 第43-44页 |
| ·猪ATGL基因cDNA的分离 | 第44-46页 |
| ·EST拼接验证 | 第44页 |
| ·3'RACE-PCR | 第44-45页 |
| ·第一链的合成 | 第44-45页 |
| ·降落PCR扩增 | 第45页 |
| ·5'RACE-PCR | 第45-46页 |
| ·第一链的制备与纯化 | 第45-46页 |
| ·第一链cDNA末端加尾 | 第46页 |
| ·巢式扩增 | 第46页 |
| ·猪ATGL基因DNA序列的分离 | 第46-50页 |
| ·猪血液基因组DNA的提取 | 第46-47页 |
| ·猪ATGL基因内含子的PCR扩增 | 第47-48页 |
| ·染色体步移 | 第48-50页 |
| ·基因组步移库DNA的提取 | 第49页 |
| ·基因组DNA的质量检测 | 第49页 |
| ·基因组DNA的消化 | 第49-50页 |
| ·基因组DNA的纯化 | 第50页 |
| ·连接接头 | 第50页 |
| ·基因组PCR步移 | 第50页 |
| ·外源片段回收、克隆和测序 | 第50-52页 |
| ·PCR产物的回收 | 第50-51页 |
| ·载体连接 | 第51页 |
| ·连接产物的转化 | 第51页 |
| ·阳性克隆子鉴定及测序 | 第51-52页 |
| ·猪ATGL基因染色体精细定位 | 第52-53页 |
| ·定位引物的设计 | 第52页 |
| ·PCR扩增分型方法 | 第52页 |
| ·PCR预扩增 | 第52页 |
| ·对RH panel扩增 | 第52页 |
| ·数据分析方法 | 第52-53页 |
| ·猪ATGL转录水平组织表达谱分析 | 第53-54页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第53页 |
| ·引物设计 | 第53页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第53-54页 |
| ·表达载体的构建 | 第54-57页 |
| ·目的片段的获得 | 第54-56页 |
| ·启动子缺失片段的获得 | 第54-55页 |
| ·编码区段的获得 | 第55-56页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第56页 |
| ·目的片段与载体的双酶切 | 第56页 |
| ·酶切后目的片段与线性载体的连接 | 第56页 |
| ·重组质粒的转化和鉴定 | 第56-57页 |
| ·重组质粒的中量提取 | 第57-58页 |
| ·细胞的培养 | 第58-59页 |
| ·细胞系的培养与传代 | 第58页 |
| ·猪原代脂肪细胞的培养 | 第58页 |
| ·细胞转染 | 第58-59页 |
| ·克隆筛选 | 第59页 |
| ·双荧光素酶活性测定 | 第59-60页 |
| ·细胞裂解 | 第59页 |
| ·双荧光素酶活性测定 | 第59-60页 |
| ·数据处理及统计分析 | 第60页 |
| ·融合蛋白在体外细胞的表达定位 | 第60页 |
| 4 结果与分析 | 第60-87页 |
| ·总RNA的提取 | 第60页 |
| ·总DNA的提取及基因组步移库的构建 | 第60-61页 |
| ·猪ATGL基因全长cDNA的克隆及特征分析 | 第61-70页 |
| ·猪ATGL基因全长cDNA的扩增及测序 | 第61-62页 |
| ·猪ATGL基因cDNA序列的生物信息学分析 | 第62-70页 |
| ·基本序列信息 | 第62-67页 |
| ·高级结构域预测 | 第67-68页 |
| ·潜在的miRNA预测 | 第68-70页 |
| ·猪ATGL全长基因的克隆 | 第70-75页 |
| ·猪ATGL基因DNA片段扩增结果 | 第70-71页 |
| ·猪ATGL基因DNA序列生物信息学分析 | 第71-75页 |
| ·猪ATGL基因的外显子和内含子组成 | 第71-72页 |
| ·猪ATGL基因与下游基因的线性排列 | 第72页 |
| ·猪ATGL基因上游的潜在转录调控区 | 第72-75页 |
| ·猪ATGL基因的染色体精细定位 | 第75-76页 |
| ·猪ATGL基因特异片段的扩增与验证 | 第75页 |
| ·利用IMpRH将猪ATGL基因定位于SSC2p17 | 第75-76页 |
| ·猪ATGL转录物在脂肪组织中的高效表达 | 第76-77页 |
| ·体外细胞中猪ATGL基因的启动子活性 | 第77-80页 |
| ·猪ATGL基因启动子缺失片段的获得 | 第77-78页 |
| ·荧光素酶报告基因表达载体的构建 | 第78-79页 |
| ·不同表达载体的荧光素酶相对活性 | 第79-80页 |
| ·猪ATGL及HSL融合蛋白的体外表达定位 | 第80-87页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第80-81页 |
| ·融合蛋白的表达定位 | 第81-82页 |
| ·细胞稳定转染的筛选 | 第82-87页 |
| ·最佳筛选浓度的确定 | 第82页 |
| ·稳定转染的筛选 | 第82-87页 |
| 5 讨论 | 第87-97页 |
| ·关于猪ATGL基因的遗传信息 | 第87-88页 |
| ·ATGL基因在染色体上的位置 | 第87-88页 |
| ·猪ATGL基因的结构 | 第88页 |
| ·关于猪ATGL基因上游启动子的转录活性分析 | 第88-90页 |
| ·为什么研究启动子 | 第88页 |
| ·双荧光素酶报告基因在启动子研究中的优势 | 第88-89页 |
| ·猪ATGL最小启动子的进一步解析 | 第89-90页 |
| ·真的存在miRNA的转录后调控吗 | 第90-92页 |
| ·miRNA的转录后微调 | 第90页 |
| ·关于猪ATGL基因下游转录后微调的分析 | 第90-92页 |
| ·关于体外细胞的融合表达 | 第92-94页 |
| ·猪ATGL和HSL蛋白在体外细胞的表达定位 | 第92-93页 |
| ·利用pEGFP-N1构建融合表达载体的注意事项 | 第93-94页 |
| ·关于转染细胞克隆的G418筛选 | 第94页 |
| ·关于猪ATGL蛋白的生物学功能 | 第94-95页 |
| ·关于猪ATGL的下一步计划和应用展望 | 第95-97页 |
| 第三章 猪ATGL、Acrp30和RSTN基因的SNPs及遗传效应分析 | 第97-117页 |
| 1 引言 | 第97页 |
| 2 试验材料 | 第97-98页 |
| ·试验猪群体和性状测定 | 第97页 |
| ·主要仪器设备及试剂 | 第97页 |
| ·主要生物学软件 | 第97-98页 |
| 3 试验方法 | 第98-100页 |
| ·候选基因的SNP筛查与检测 | 第98-100页 |
| ·猪ATGL基因外显子2 G392A突变 | 第98-99页 |
| ·猪Acrp30外显子2的A/G突变 | 第99页 |
| ·猪Acrp30基因内含子2的A/G突变 | 第99-100页 |
| ·猪RSTN基因14bp的缺失/插入突变 | 第100页 |
| ·统计分析 | 第100页 |
| 4 结果与分析 | 第100-112页 |
| ·猪ATGL基因的SNP检测及遗传效应分析 | 第100-104页 |
| ·猪ATGL基因的SNP扫描结果 | 第100-101页 |
| ·外显子2 G392A的PCR-RFLP结果 | 第101-102页 |
| ·外显子2 G392A的多态性分布 | 第102页 |
| ·外显子2 G392A的遗传效应分析 | 第102-104页 |
| ·猪Acrp30基因的SNP检测及遗传效应分析 | 第104-109页 |
| ·猪Acrp30基因外显子2 A178G位点分析 | 第104-106页 |
| ·外显子2 A178G的PCR-RFLP结果 | 第104页 |
| ·外显子2 A178G的多态性分布 | 第104-105页 |
| ·外显子2 A178G的遗传效应分析 | 第105-106页 |
| ·猪Acrp30基因内含子2 A958G位点分析 | 第106-109页 |
| ·内含子2 A958G的PCR-SSCP结果 | 第106页 |
| ·内含子2 A958G的测序验证 | 第106-107页 |
| ·内含子2 A958G的多态性分布 | 第107页 |
| ·内含子2 A958G的遗传效应分析 | 第107-109页 |
| ·猪RSTN基因的SNP检测及遗传效应分析 | 第109-112页 |
| ·猪RSTN基因的SNPs扫描结果 | 第109页 |
| ·内含子2缺失/插入的PCR-PAGE结果 | 第109-110页 |
| ·内含子2缺失/插入的多态性分布 | 第110页 |
| ·内含子2缺失/插入的遗传效应分析 | 第110-112页 |
| 5 讨论 | 第112-117页 |
| ·猪ATGL基因多态位点的遗传效应与分子机制 | 第112-113页 |
| ·遗传效应分析 | 第112页 |
| ·可能的分子机制 | 第112-113页 |
| ·猪Acrp30的多态位点的遗传效应与分子机制 | 第113-115页 |
| ·猪Acrp30外显子1 A178G的遗传效应及分子机制 | 第113-114页 |
| ·猪Acrp30内含子2 A/G的遗传效应 | 第114-115页 |
| ·猪RSTN基因多态位点的遗传效应 | 第115页 |
| ·内含子SNPs的分子机制分析 | 第115-117页 |
| 小结 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-130页 |
| 附录1 资源家系测定性状的英文缩写 | 第130-131页 |
| 附录2 PGL3-Q重组质粒序列 | 第131-133页 |
| 附录3 EGFP融合表达载体测序结果 | 第133-136页 |
| 致谢 | 第136-137页 |
| 在读期间发表论文情况 | 第137页 |
