| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略词表 | 第8-9页 |
| 1 前言 | 第9-15页 |
| ·人肥胖基因的发现 | 第9页 |
| ·人ob基因和leptin的基本结构 | 第9-10页 |
| ·ob基因的基本结构 | 第9页 |
| ·leptin的基本结构 | 第9-10页 |
| ·人leptin受体(ob-R) | 第10-11页 |
| ·人leptin的功能 | 第11-13页 |
| ·leptin与体重 | 第11页 |
| ·leptin与生殖发育 | 第11页 |
| ·leptin与免疫功能 | 第11-12页 |
| ·leptin与妊娠和胎儿的发育 | 第12页 |
| ·leptin与造血功能 | 第12页 |
| ·leptin对骨代谢的作用 | 第12-13页 |
| ·leptin对组织代谢的作用 | 第13页 |
| ·人ob基因的体外表达研究 | 第13页 |
| ·毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统 | 第13-15页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第13-14页 |
| ·毕赤酵母表达系统的应用 | 第14-15页 |
| 2 本研究的目的与意义 | 第15-16页 |
| 3 材料与方法 | 第16-26页 |
| ·材料 | 第16-19页 |
| ·质粒与菌株 | 第16页 |
| ·主要试剂 | 第16页 |
| ·主要溶液的配制 | 第16-19页 |
| ·方法 | 第19-26页 |
| ·人ob片段的PCR扩增 | 第19-20页 |
| ·人ob片段PCR扩增产物的回收 | 第20页 |
| ·人ob片段和酵母表达载体pPIC9K的双酶切 | 第20页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第20-21页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第21页 |
| ·连接产物的转化 | 第21-22页 |
| ·重组质粒的快速鉴定 | 第22页 |
| ·质粒的提取(碱裂解法) | 第22页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第22页 |
| ·人ob基因的序列测定 | 第22页 |
| ·重组表达载体的线型化 | 第22-23页 |
| ·酵母菌感受态细胞的制备 | 第23页 |
| ·酵母菌的转化 | 第23页 |
| ·酵母基因组 PCR模板制备 | 第23-24页 |
| ·酵母阳性重组子 PCR筛选 | 第24页 |
| ·阳性转化子 Mut表型鉴定 | 第24页 |
| ·重组酵母的小量诱导表达 | 第24-25页 |
| ·多拷贝酵母重组子的筛选 | 第25页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第25页 |
| ·人ob基因的改造及其在毕赤酵母中的表达 | 第25页 |
| ·放免检测分析 | 第25-26页 |
| 4 结果与分析 | 第26-32页 |
| ·人ob基因cDNA的获得 | 第26页 |
| ·重组质粒酶切鉴定 | 第26-27页 |
| ·重组质粒的 PCR鉴定 | 第27页 |
| ·人ob基因序列测定结果 | 第27-28页 |
| ·重组酵母的鉴定与表达(基因未改造) | 第28-29页 |
| ·人ob基因的密码子改造结果 | 第29-30页 |
| ·基因改造后重组酵母的鉴定 | 第30页 |
| ·Mut表型鉴定 | 第30页 |
| ·诱导产物的放免分析及阳性重组子G418抗性分析 | 第30-31页 |
| ·诱导产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第31-32页 |
| 5 讨论 | 第32-35页 |
| ·酵母表达重组质粒的构建 | 第32页 |
| ·阳性克隆 PCR模板制备 | 第32页 |
| ·酵母表达重组质粒转化与筛选 | 第32-33页 |
| ·酵母的诱导表达 | 第33-35页 |
| 6 小结 | 第35-36页 |
| 参考文献 | 第36-42页 |
| 致谢 | 第42页 |