| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-18页 |
| 前言 | 第18-20页 |
| 第一章 绪论 | 第20-42页 |
| 1．1 手性化合物的重要性和研究现状 | 第20-21页 |
| 1．1．1 手性化合物的重要性 | 第20-21页 |
| 1．1．2 手性技术的研究现状 | 第21页 |
| 1．2 制备手性化合物的主要方法 | 第21-24页 |
| 1．2．1 手性拆分 | 第22页 |
| 1．2．2 化学合成 | 第22-23页 |
| 1．2．3 生物催化 | 第23-24页 |
| 1．3 微生物催化手性合成的特点和优势 | 第24-26页 |
| 1．4 生物催化β-羰基酯不对称还原反应研究进展 | 第26-32页 |
| 1．4．1 微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称合成的原理 | 第27-28页 |
| 1．4．2 催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的微生物 | 第28-29页 |
| 1．4．3 酵母细胞中催化β-羰基酯不对称还原的酶 | 第29-30页 |
| 1．4．4 生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的方法 | 第30页 |
| 1．4．5 影响微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯的因素 | 第30-32页 |
| 1．5 不对称还原反应过程中的辅酶再生问题 | 第32-34页 |
| 1．5．1 酶偶联法再生 | 第32页 |
| 1．5．2 电化学法 | 第32-33页 |
| 1．5．3 光化学法 | 第33页 |
| 1．5．4 利用微生物细胞辅酶再生 | 第33-34页 |
| 1．6 微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯还原反应的酶动力学 | 第34-35页 |
| 1．7 本课题拟研究的内容 | 第35页 |
| 参考文献 | 第35-42页 |
| 第二章 材料与方法 | 第42-50页 |
| 2．1 试验材料 | 第42-43页 |
| 2．1．1 质粒 | 第42页 |
| 2．1．2 菌株 | 第42页 |
| 2．1．3工具酶与试剂 | 第42页 |
| 2．1．4 培养基 | 第42-43页 |
| 2．1．5 主要仪器 | 第43页 |
| 2．2 试验与分析方法 | 第43-47页 |
| 2．2．1 分子克隆试验 | 第43页 |
| 2．2．2 菌体浓度测定 | 第43页 |
| 2．2．3 重组菌细胞超声破碎及胞内酶蛋白提取 | 第43-44页 |
| 2．2．4 蛋白浓度测定 | 第44页 |
| 2．2．5 SDS-PAGE电泳 | 第44页 |
| 2．2．6 重组菌表达酶的比活性(specific activity)测定 | 第44-46页 |
| 2．2．7 气／液相色谱测定底物和产物及e．e．值计算 | 第46-47页 |
| 2．2．8 数据处理方法 | 第47页 |
| 参考文献 | 第47-50页 |
| 第三章 醛基还原酶基因克隆、表达载体的构建及表达条件优化 | 第50-66页 |
| 3．1 引言 | 第50页 |
| 3．2 材料和方法 | 第50-57页 |
| 3．2．1质粒 | 第50-51页 |
| 3．2．2 菌株和培养基 | 第51-52页 |
| 3．2．3 酶和试剂盒 | 第52-53页 |
| 3．2．4 质粒提取和转化 | 第53页 |
| 3．2．5 醛基还原酶(aldehyde reductase，ALR)基因的克隆与重组质粒的构建 | 第53-56页 |
| 3．2．6 不同表达菌株的构建 | 第56页 |
| 3．2．7 菌体培养及酶蛋白表达 | 第56-57页 |
| 3．2．8 重组表达菌醛基还原酶活的测定 | 第57页 |
| 3．2．9 重组菌株不对称还原反应体系 | 第57页 |
| 3．2．10 细胞活性的检测 | 第57页 |
| 3．2．11 产物气／液相检测及e．e．值 | 第57页 |
| 3．3 结果与讨论 | 第57-64页 |
| 3．3．1 不同转化子表达醛基还原酶活性测定 | 第57-58页 |
| 3．3．2 重组菌株M15(pQE30-ALR)与原始酵母菌株酶活性比较及酶蛋白表达 | 第58-60页 |
| 3．3．3 重组菌株M15(pQE30-ALR)培养条件和诱导条件的优化 | 第60-64页 |
| 3．4 小结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-66页 |
| 第四章 重组大肠杆菌表达醛基还原酶不对称还原生产R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究 | 第66-78页 |
| 4．1 引言 | 第66页 |
| 4．2 材料与方法 | 第66-67页 |
| 4．2．1 试验材料 | 第66-67页 |
| 4．2．2 试验方法 | 第67页 |
| 4．3 结果与讨论 | 第67-76页 |
| 4．3．1 重组菌表达醛基还原酶不对称还原COBE的反应特性 | 第67-69页 |
| 4．3．2 辅酶再生对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响 | 第69-70页 |
| 4．3．3 底物浓度对重组细胞不对称还原反应的影响 | 第70-71页 |
| 4．3．4 产物浓度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响 | 第71-72页 |
| 4．3．5 pH值对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响 | 第72-73页 |
| 4．3．6 反应温度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响 | 第73-74页 |
| 4．3．7 细胞密度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响 | 第74-75页 |
| 4．3．8 分批加入底物提高重组菌不对称还原反应的产率 | 第75-76页 |
| 4．4 小结 | 第76页 |
| 参考文献 | 第76-78页 |
| 第五章 重组菌高效表达葡萄糖脱氢酶及在还原型辅酶NADPH再生中的应用 | 第78-96页 |
| 5．1 引言 | 第78-79页 |
| 5．2 材料与方法 | 第79-82页 |
| 5．2．1 试验试剂 | 第79页 |
| 5．2．2 质粒与菌株 | 第79页 |
| 5．2．3 培养基与培养条件 | 第79-80页 |
| 5．2．4 葡萄糖脱氢酶基因的克隆 | 第80-81页 |
| 5．2．5 葡萄糖脱氢酶表达载体的构建 | 第81页 |
| 5．2．6 葡萄糖脱氢酶酶活力的测定 | 第81-82页 |
| 5．2．7 还原型辅酶NADPH浓度的测定 | 第82页 |
| 5．2．8 产物气相和液相色谱测定 | 第82页 |
| 5．3 结果与讨论 | 第82-93页 |
| 5．3．1 重组菌表达葡萄糖脱氢酶的性质 | 第82-83页 |
| 5．3．2 克隆和重组表达的葡萄糖脱氢酶基因的测序及同源性分析 | 第83-84页 |
| 5．3．3 重组菌表达葡萄糖脱氢酶酶比活性的测定 | 第84-86页 |
| 5．3．4 重组菌M15(pQE30-gdh223)表达葡萄糖脱氢酶条件优化 | 第86-88页 |
| 5．3．5 重组菌M15(pQE30-gdh223)实现辅酶的产生与再生 | 第88-91页 |
| 5．3．6 重组菌M15(pQE30-gdh223)在生物催化不对称反应中的应用 | 第91-93页 |
| 5．4 小结 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-96页 |
| 第六章 重组菌E．coli M15(pQE30-gdh223)与E．coli M15(pQE30-ALR)耦合催化COBE不对称还原的研究 | 第96-110页 |
| 6．1 引言 | 第96页 |
| 6．2 材料和方法 | 第96-97页 |
| 6．2．1 菌种 | 第96-97页 |
| 6．2．2 培养基及培养方法 | 第97页 |
| 6．2．3 酶活测定和细胞活性的研究 | 第97页 |
| 6．2．4 不对称还原反应体系 | 第97页 |
| 6．2．5 气相和液相色谱检测 | 第97页 |
| 6．3 结果和讨论 | 第97-107页 |
| 6．3．1 两重组菌耦合实现还原型辅酶再生的反应机理 | 第97-99页 |
| 6．3．2 底物浓度和两种重组菌质量比对双菌耦合转化反应的影响 | 第99-100页 |
| 6．3．3 反应温度对双菌耦合转化反应的影响 | 第100-101页 |
| 6．3．4 葡萄糖浓度对双菌耦合转化反应的影响 | 第101-102页 |
| 6．3．5 转速对双菌耦合转化反应的影响 | 第102-103页 |
| 6．3．6 底物分批加入对提高双菌耦合转化率的影响 | 第103-104页 |
| 6．3．7 两相体系双菌耦合转化COBE的研究 | 第104-107页 |
| 6．4 小结 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-110页 |
| 第七章 葡萄糖脱氢酶和醛基还原酶协同催化COBE不对称还原反应的酶动力学研究 | 第110-128页 |
| 7．1 引言 | 第110页 |
| 7．2 材料与方法 | 第110-115页 |
| 7．2．1 试验试剂 | 第110页 |
| 7．2．2 初酶提取与纯化 | 第110页 |
| 7．2．3 酶蛋白浓度测定 | 第110-111页 |
| 7．2．4 反应初速度测定 | 第111页 |
| 7．2．5 产物气相和液相色谱检测 | 第111页 |
| 7．2．6 数学模型的建立 | 第111-115页 |
| 7．3 结果与讨论 | 第115-122页 |
| 7．3．1 传质对酶的影响 | 第115-116页 |
| 7．3．2 醛基还原酶催化COBE还原反应的动力学常数的确定 | 第116-119页 |
| 7．3．3 葡萄糖脱氢酶催化COBE还原反应的动力学常数的确定 | 第119-122页 |
| 7．4 双酶耦合辅酶循环再生催化COBE还原反应动力学 | 第122-125页 |
| 7．4．1 双酶体系反应初速度的求解 | 第123页 |
| 7．4．2 双酶的酶活性比对双酶体系转化效率的影响 | 第123页 |
| 7．4．3 总辅酶浓度对双酶体系转化效率的影响 | 第123-124页 |
| 7．4．4 对双酶体系辅酶随时间变化曲线的模拟 | 第124-125页 |
| 7．5 小结 | 第125页 |
| 参考文献 | 第125-128页 |
| 第八章 双菌耦合体系催化COBE不对称还原生产S-CHBE的研究 | 第128-142页 |
| 8．1 引言 | 第128-129页 |
| 8．2 材料和方法 | 第129-131页 |
| 8．2．1 质粒、菌种和菌体培养 | 第129页 |
| 8．2．2 工具酶和试剂盒 | 第129页 |
| 8．2．3 羰基还原酶基因的克隆 | 第129页 |
| 8．2．4 羰基还原酶表达载体的构建 | 第129-130页 |
| 8．2．5 羰基还原酶酶活测定 | 第130-131页 |
| 8．2．6 转化反应体系 | 第131页 |
| 8．2．7 产物气相和液相检测 | 第131页 |
| 8．3 结果与讨论 | 第131-140页 |
| 8．3．1 培养基的优化 | 第131页 |
| 8．3．2 诱导时间和诱导剂量的优化 | 第131-132页 |
| 8．3．3 表达时间的确定 | 第132-133页 |
| 8．3．4 重组菌与原始菌株比酶活的比较 | 第133-134页 |
| 8．3．5 重组菌表达羰基还原酶不对称还原COBE的反应产物检测 | 第134-135页 |
| 8．3．6 辅酶再生对重组菌E．coliM15(pQE30-CAR)不对称还原COBE的影响 | 第135-136页 |
| 8．3．7 底物浓度对单菌转化及双菌耦合转化体系产率的影响 | 第136-137页 |
| 8．3．8 E．coli M15(pQE30-CAR)及E．coli M15(pQE30-gdh223)质量比对产物得率的影响 | 第137-138页 |
| 8．3．9 温度对双菌耦合转化反应的产率的影响 | 第138页 |
| 8．3．10 两相体系分批补加菌体对双菌耦合转化反应产率的影响 | 第138-140页 |
| 8．4 小结 | 第140页 |
| 参考文献 | 第140-142页 |
| 结论 | 第142-146页 |
| 本论文符号表 | 第146-147页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第147-148页 |
| 致谢 | 第148页 |
