| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-17页 |
| 1 引言 | 第17-54页 |
| ·果树病毒危害及特点 | 第17-19页 |
| ·果树病毒危害 | 第17-18页 |
| ·果树病毒病的主要特点 | 第18-19页 |
| ·果树病毒病的研究概况 | 第19-23页 |
| ·国外研究概况 | 第19-21页 |
| ·国内研究概况 | 第21-23页 |
| ·果树病毒病的检测技术 | 第23-47页 |
| ·果树病毒病的外观症状诊断法 | 第23页 |
| ·果树病毒病的指示植物检测法 | 第23-24页 |
| ·果树病毒病的电子显微镜检测法 | 第24页 |
| ·果树病毒病的血清学检测法 | 第24-25页 |
| ·分子生物学检测法 | 第25-47页 |
| ·核酸分子杂交技术 | 第26-32页 |
| ·核酸杂交技术的优越性 | 第26-27页 |
| ·核酸探针的来源 | 第27-28页 |
| ·核酸探针的制备 | 第28页 |
| ·探针的标记物 | 第28-31页 |
| ·杂交方法 | 第31页 |
| ·核酸杂交支持膜 | 第31-32页 |
| ·影响核酸杂交的因素 | 第32页 |
| ·多聚酶链式反应(PCR)技术 | 第32-33页 |
| ·逆转录-聚合链式反应(RT-PCR) | 第33-36页 |
| ·双链RNA(dsRNA)技术 | 第36-41页 |
| ·dsRNA的产生 | 第36-37页 |
| ·dsRNA检测技术在果树上的应用 | 第37-41页 |
| ·果树病毒病及病源鉴定 | 第37-38页 |
| ·病毒分化株系的鉴定 | 第38-39页 |
| ·以dsRNA为中介对病毒核酸序列进行研究 | 第39-40页 |
| ·探针的制备和cDNA克隆的获得 | 第40页 |
| ·用于检测病毒卫星RNA和亚基因组RNA | 第40-41页 |
| ·其他用途 | 第41页 |
| ·其他方法 | 第41-42页 |
| ·免疫电镜法 | 第41-42页 |
| ·免疫捕获PCR(IC-PCR) | 第42页 |
| ·原位PCR技术 | 第42-47页 |
| ·原位逆转录PCR的基本原理 | 第43页 |
| ·原位逆转录PCR的原则和方法 | 第43-45页 |
| ·样品制备 | 第43-44页 |
| ·逆转录及PCR反应 | 第44-45页 |
| ·细胞内PCR产物的检测 | 第45页 |
| ·对照的设置 | 第45-46页 |
| ·原位PCR的应用 | 第46-47页 |
| ·梨树病毒病害的研究 | 第47-52页 |
| ·梨树病毒病的特点 | 第47-48页 |
| ·梨环纹花叶病毒与苹果褪绿叶斑病毒及梨脉黄病毒与苹果茎痘病毒之间的关系 | 第48-49页 |
| ·几种主要梨病毒特征 | 第49-52页 |
| ·果树病毒病研究的展望 | 第52-54页 |
| 2 材料与方法 | 第54-75页 |
| ·材料 | 第54-55页 |
| ·供试材料 | 第54页 |
| ·菌株 | 第54页 |
| ·质粒 | 第54页 |
| ·引物 | 第54-55页 |
| ·试剂及酶类 | 第55页 |
| ·主要仪器 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-75页 |
| ·梨组织RNA的提取 | 第55-58页 |
| ·梨组织中总RNA的提取 | 第55-56页 |
| ·异硫氰酸胍法 | 第55-56页 |
| ·TRIzol法 | 第56页 |
| ·方法M | 第56页 |
| ·试剂盒法 | 第56页 |
| ·梨组织中dsRNA的提取 | 第56-57页 |
| ·梨组织中总核酸的提取 | 第57-58页 |
| ·PEX法 | 第57-58页 |
| ·盐酸胍法 | 第58页 |
| ·库尔勒香梨病毒的多重RT-PCR检测体系 | 第58-65页 |
| ·库尔勒香梨病毒的RT-PCR检测体系的优化 | 第58-59页 |
| ·cDNA合成 | 第58页 |
| ·PCR扩增 | 第58-59页 |
| ·RT体系的优化 | 第59页 |
| ·PCR体系的优化 | 第59页 |
| ·一步法RT-PCR检测体系 | 第59-60页 |
| ·库尔勒香梨上ASGV、ACLSV、ASPV的多重RT-PCR检测体系的建立 | 第60-61页 |
| ·内标体系的建立 | 第60页 |
| ·多重RT-PCR体系 | 第60-61页 |
| ·cDNA合成 | 第60页 |
| ·多重PCR扩增 | 第60-61页 |
| ·目的片段转化大肠杆菌 | 第61-64页 |
| ·DNA片段的切胶纯化 | 第61-62页 |
| ·与载体质粒的连接 | 第62页 |
| ·氯化钙法转化 | 第62-64页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第62-63页 |
| ·转化 | 第63页 |
| ·碱裂解法小量提取质粒 | 第63页 |
| ·重组克隆的酶切鉴定 | 第63-64页 |
| ·重组克隆的PCR鉴定 | 第64页 |
| ·序列测定与分析 | 第64页 |
| ·DNA序列测定 | 第64页 |
| ·DNA序列分析 | 第64页 |
| ·库尔勒香梨病毒的RT-PCR检测试剂盒 | 第64-65页 |
| ·库尔勒香梨病毒的cDNA探针检测体系 | 第65-67页 |
| ·库尔勒香梨病毒的cDNA探针检测体系的优化 | 第65-67页 |
| ·非放射性标记cDNA探针的制备 | 第65页 |
| ·探针显色灵敏度的检测 | 第65页 |
| ·RNA点杂交的常规方法 | 第65-66页 |
| ·库尔勒香梨病毒斑点杂交检测体系的优化 | 第66-67页 |
| ·斑点杂交检测体系的优化 | 第66-67页 |
| ·不同杂交膜比较 | 第67页 |
| ·不同封闭剂对杂交信号检测影响 | 第67页 |
| ·改进方法 | 第67页 |
| ·库尔勒香梨病毒的核酸点杂交检测试剂盒 | 第67页 |
| ·病毒样品的检测 | 第67页 |
| ·库尔勒香梨病毒的原位PCR检测体系 | 第67-75页 |
| ·库尔勒香梨叶片病毒的原位PCR检测体系 | 第67-71页 |
| ·玻片处理 | 第67-68页 |
| ·石蜡切片制作法 | 第68页 |
| ·组织预处理 | 第68-69页 |
| ·反转录反应 | 第69-70页 |
| ·原位PCR扩增 | 第70页 |
| ·原位PCR产物的免疫检测 | 第70-71页 |
| ·对照的设置 | 第71页 |
| ·果胶酶处理时间 | 第71页 |
| ·蛋白酶处理时间 | 第71页 |
| ·退火温度不同处理 | 第71页 |
| ·有效RT反应体系的建立 | 第71页 |
| ·扩增中各因素对试验结果影响的研究 | 第71页 |
| ·库尔勒香梨茎尖病毒的原位PCR检测 | 第71-75页 |
| ·玻片处理 | 第72页 |
| ·冷冻切片的制作 | 第72页 |
| ·组织预处理 | 第72页 |
| ·一步法RT-PCR反应 | 第72-73页 |
| ·原位杂交 | 第73页 |
| ·原位PCR产物的免疫检测 | 第73-74页 |
| ·对照的设置 | 第74-75页 |
| 3 结果与分析 | 第75-118页 |
| ·梨组织RNA的提取 | 第75-76页 |
| ·梨组织中总RNA的提取 | 第75-76页 |
| ·梨组织中dsRNA的提取 | 第76页 |
| ·梨组织中总核酸的提取 | 第76页 |
| ·库尔勒香梨病毒的多重RT-PCR检测体系 | 第76-98页 |
| ·库尔勒香梨病毒的RT-PCR检测体系的优化 | 第76-87页 |
| ·RT体系的优化 | 第77-82页 |
| ·PCR体系的优化 | 第82-87页 |
| ·一步法RT-PCR检测体系 | 第87-88页 |
| ·库尔勒香梨上ASGV、ACLSV、ASPV的多重RT-PCR检测体系的建立 | 第88-92页 |
| ·内标体系的建立 | 第88-90页 |
| ·多重RT-PCR体系 | 第90-92页 |
| ·RT-PCR产物的转化、筛选和鉴定 | 第92-93页 |
| ·目的片段的序列分析与比较 | 第93-97页 |
| ·库尔勒香梨病毒的RT-PCR检测试剂盒 | 第97-98页 |
| ·试剂组成及配方 | 第97页 |
| ·操作方法 | 第97-98页 |
| ·库尔勒香梨病毒的cDNA探针检测体系 | 第98-105页 |
| ·库尔勒香梨病毒的cDNA探针检测体系的优化 | 第98-103页 |
| ·非放射性标记cDNA探针的鉴定 | 第98-99页 |
| ·探针显色灵敏度的检测 | 第99页 |
| ·RNA点杂交的常规方法 | 第99-100页 |
| ·库尔勒香梨病毒斑点杂交检测体系的优化 | 第100-103页 |
| ·斑点杂交检测体系的优化 | 第100-102页 |
| ·不同杂交膜比较 | 第102-103页 |
| ·不同封闭剂对杂交信号检测影响 | 第103页 |
| ·库尔勒香梨病毒的核酸点杂交检测试剂盒 | 第103-105页 |
| ·杂交试剂盒的组成 | 第103-104页 |
| ·操作方法 | 第104-105页 |
| ·病毒样品的检测 | 第105页 |
| ·库尔勒香梨病毒的原位PCR检测体系 | 第105-118页 |
| ·库尔勒香梨叶片病毒的原位PCR检测体系 | 第105-114页 |
| ·不同处理对石蜡切片制作效果的影响 | 第105-106页 |
| ·不同组织预处理对原位切片效果的影响 | 第106-108页 |
| ·反转录反应组分浓度对原位PCR效果的影响 | 第108-111页 |
| ·原位扩增中各因素对PCR效果的影响 | 第111-114页 |
| ·库尔勒香梨茎尖病毒的原位PCR检测 | 第114-118页 |
| 4 讨论 | 第118-128页 |
| ·梨组织中总RNA、dsRNA及总核酸的提取 | 第118-119页 |
| ·库尔勒香梨病毒的多重RT-PCR检测体系 | 第119-121页 |
| ·库尔勒香梨病毒的cDNA探针检测体系 | 第121-123页 |
| ·香梨病毒检测试剂盒的研制 | 第123-124页 |
| ·库尔勒香梨病毒的原位PCR检测体系 | 第124-128页 |
| ·固定剂的选用与固定时间的确定 | 第124页 |
| ·切片的防脱 | 第124页 |
| ·反应中蒸发的防止 | 第124-125页 |
| ·蛋白酶消化时间的确定 | 第125页 |
| ·地高辛标记核苷酸的使用 | 第125-126页 |
| ·原位PCR的反应体系各组分对结果的影响 | 第126页 |
| ·循环次数 | 第126页 |
| ·标本的洗涤 | 第126-127页 |
| ·原位PCR检测梨病毒的敏感性与特异性 | 第127-128页 |
| 5 结论 | 第128-130页 |
| ·梨组织RNA、dsRNA、总核酸的提取 | 第128页 |
| ·库尔勒香梨病毒的多重RT-PCR检测体系 | 第128页 |
| ·库尔勒香梨病毒的cDNA探针检测体系 | 第128页 |
| ·库尔勒香梨病毒分子检测试剂盒 | 第128-129页 |
| ·库尔勒香梨病毒的原位PCR检测体系 | 第129-130页 |
| 参考文献 | 第130-143页 |
| 致谢 | 第143-144页 |
| 附录1: 缩写词和英汉对照 | 第144-146页 |
| 附录2: 本研究使用的主要试剂与溶液的配制 | 第146-150页 |
| 附录3: 攻读博士期间已发表的主要论文和著作 | 第150-151页 |
| 附录4: 测序原始图谱 | 第151-155页 |
