| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一篇 酿酒酵母中Iml3-Chl4复合物的结构与功能研究 | 第15-100页 |
| 第一部分 综述 | 第15-30页 |
| 1.1 着丝粒的研究进展 | 第15-21页 |
| 1.1.1 着丝粒及其功能 | 第15页 |
| 1.1.2 着丝粒DNA的多样性及其分类 | 第15-18页 |
| 1.1.3 着丝粒的表观遗传标志--CENP-A蛋白 | 第18-19页 |
| 1.1.4 CENP-A核小体在整个细胞周期的功能 | 第19-21页 |
| 1.2 动粒的功能与组成 | 第21-26页 |
| 1.2.1 动粒的功能 | 第21-22页 |
| 1.2.2 动粒的组成 | 第22-26页 |
| 1.2.2.1 CCAN(constitutive centromere-associated network)组成了内层动粒 | 第22-23页 |
| 1.2.2.2 KMN蛋白网络组成了外层动粒蛋白并控制着微管结合 | 第23-24页 |
| 1.2.2.3 外层动粒的调节作用 | 第24-26页 |
| 1.3 Iml3-Chl4及其同源蛋白在高等真核生物中的发现及功能研究 | 第26-30页 |
| 1.3.1 人源Iml3-Chl4同源蛋白CENP-L-CENP-N的发现与研究 | 第26-28页 |
| 1.3.1.1 CENP-N对CENP-A核小体的识别特异性 | 第27页 |
| 1.3.1.2 CENP-N与CENP-L的相互作用 | 第27-28页 |
| 1.3.2 酿酒酵母Iml3与Chl4的发现与研究 | 第28-30页 |
| 1.3.2.1 酿酒酵母Iml3与Chl4在动粒组装中的作用 | 第28-29页 |
| 1.3.2.2 酿酒酵母Iml3与Chl4在减数分裂中的作用 | 第29页 |
| 1.3.2.3 酿酒酵母Iml3与Chl4的相互作用 | 第29-30页 |
| 本篇拟解决的问题 | 第30-31页 |
| 第二部分 实验材料与方法 | 第31-39页 |
| 2.1 基因克隆与质粒构建 | 第31-32页 |
| 2.1.1 目的基因的克隆 | 第31页 |
| 2.1.2 目的基因片段的凝胶回收、双酶切及载体连接 | 第31-32页 |
| 2.1.3 连接产物的转化 | 第32页 |
| 2.1.4 菌液PCR鉴定及质粒抽提 | 第32页 |
| 2.2 重组蛋白的表达与纯化 | 第32-34页 |
| 2.2.1 重组蛋白的表达 | 第32-33页 |
| 2.2.2 重组蛋白的纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.2.1 ImL3全长蛋白的纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.2.2 Iml3-Chl4~(378-458)蛋白复合物的纯化 | 第34页 |
| 2.2.3 蛋白的晶体生长 | 第34页 |
| 2.2.3.1 Iml3蛋白的晶体生长 | 第34页 |
| 2.2.3.2 Iml3-Chl4~(378-458)蛋白复合物的晶体生长 | 第34页 |
| 2.3 晶体数据的收集与处理 | 第34-35页 |
| 2.3.1 Iml3蛋白晶体的数据收集与数据处理 | 第34-35页 |
| 2.3.2 Iml3-Chl4~(378-458)蛋白晶体的数据收集与处理 | 第35页 |
| 2.4 结构解析 | 第35-36页 |
| 2.4.1 单波长反常散射法(SAD)解析Iml3蛋白的晶体结构 | 第35-36页 |
| 2.4.2 分子置换法解析Iml3-Chl4~(378-458)蛋白复合物的晶体结构 | 第36页 |
| 2.5 聚丙烯酰胺凝胶阻滞迁移实验 | 第36-37页 |
| 2.6 荧光偏振实验(FPA) | 第37-38页 |
| 2.7 Pull-down实验 | 第38页 |
| 2.8 分子排租层析实验 | 第38-39页 |
| 第三部分 实验结果与讨论 | 第39-90页 |
| 3.1 Iml3蛋白的表达纯化与结晶 | 第39-40页 |
| 3.2 Chl4蛋白及其截断片段的表达纯化 | 第40页 |
| 3.3 Iml3-Chl4~(378-458)蛋白复合物的表达纯化与结晶 | 第40-41页 |
| 3.4 衍射数据的收集及处理 | 第41-46页 |
| 3.4.1 衍射数据的收集 | 第41-42页 |
| 3.4.2 衍射数据的处理 | 第42-46页 |
| 3.4.2.1 Iml3-Chl4~(378-458)复合物晶体的衍射数据处理 | 第42-46页 |
| 3.4.2.1.1 Iml3-Chl4~(378-458)复合物数据的连续处理与分组理 | 第43-46页 |
| 3.5 结构解析与质量分析 | 第46-71页 |
| 3.5.1 单波长反常散射法解析Iml3的晶体结构 | 第46-48页 |
| 3.5.1.1 结构解析与初步修正 | 第46-48页 |
| 3.5.2 Iml3结构模型的质量分析 | 第48-51页 |
| 3.5.2.1 结构模型与电子密度轮廓的吻合情况 | 第48-49页 |
| 3.5.2.2 结构模型的温度因子分析 | 第49-50页 |
| 3.5.2.3 结构模型的实空间相关系数分析 | 第50页 |
| 3.5.2.4 结构模型的立体化学分析 | 第50-51页 |
| 3.5.3 硒原子的分布对整体结构的影响 | 第51-52页 |
| 3.5.4 已发表的结构模型与重新解析的结构模型的比较 | 第52-54页 |
| 3.5.5 分子置换法解析Iml3-Chl4~(378-458)复合物的晶体结构 | 第54-55页 |
| 3.5.5.1 结构解析与初步修正 | 第54-55页 |
| 3.5.6 分辨率3.85(?)的Iml3-Chl4~(378-458)结构模型的质量分析 | 第55-59页 |
| 3.5.6.1 结构模型与电子密度的吻合情况 | 第55-56页 |
| 3.5.6.2 结构模型的温度因子分析 | 第56-57页 |
| 3.5.6.3 结构模型的实空间相关系数分析 | 第57页 |
| 3.5.6.4 结构模型的立体化学分析 | 第57-59页 |
| 3.5.7 分辨率3.6(?)的Iml3-Chl4~(378-458)结构模型的质量分析 | 第59-63页 |
| 3.5.7.1 结构模型与电子密度的吻合情况 | 第59-60页 |
| 3.5.7.2 结构模型的温度因子分析 | 第60-61页 |
| 3.5.7.3 结构模型的实空间相关系数分析 | 第61-62页 |
| 3.5.7.4 结构模型的立体化学分析 | 第62-63页 |
| 3.5.8 分辨率3.6(?)的Iml3-Chl4~(378-458)结构模型准确性的进一步分析 | 第63-67页 |
| 3.5.8.1 NCS约束对整个结构模型的影响 | 第63-65页 |
| 3.5.8.2 Omit修正后的电子密度及参数比较 | 第65-67页 |
| 3.5.9 不同分辨率结构模型中的分子模型参数比较 | 第67-71页 |
| 3.6 结构分析 | 第71-90页 |
| 3.6.1 Iml3的整体结构分析 | 第71-75页 |
| 3.6.2 Iml3-Chl4~(378-458)复合物的整体结构分析 | 第75-76页 |
| 3.6.3 Iml3与Chl4~(378-458)之间的相互作用 | 第76-79页 |
| 3.6.4 Iml3与Chl4~(378-458)相互作用界面的保守性分析 | 第79-80页 |
| 3.6.5 Iml3-Chl4~(378-458)复合物的结构差异以及原因分析 | 第80-82页 |
| 3.6.5.1 Iml3-Chl4~(378-458)复合物的结构差异 | 第80-81页 |
| 3.6.5.2 Iml3-Chl4~(378-458)复合物结构差异的原因分析 | 第81-82页 |
| 3.6.6 Iml3-Chl4~(378-458)的dsDNA结合特征及其保守性分析 | 第82-87页 |
| 3.6.6.1 Iml3-Chl4~(378-458)的dsDNA结合特征 | 第83-85页 |
| 3.6.6.2 Iml3-Chl4~(378-458)的dsDNA结合特征的保守性分析 | 第85-87页 |
| 3.6.7 Iml3-Chl4~(378-458)异源二聚体在着丝粒定位与染色体分离中的重要性 | 第87-88页 |
| 3.6.8 Iml3与Chl4的动粒组装模式推测 | 第88-90页 |
| 本篇讨论 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-100页 |
| 第二篇 膜蛋白NPCl(Niemann-Pick disease,type Cl)的表达纯化 | 第100-127页 |
| 第四部分 综述 | 第100-107页 |
| 4.1 NPC1作为细胞内的胆固醇转运蛋白 | 第100-104页 |
| 4.1.1 胆固醇的分布及作用 | 第100-101页 |
| 4.1.2 哺乳动物细胞内脂类的转运及分布 | 第101-102页 |
| 4.1.3 “Handoff”模型 | 第102-103页 |
| 4.1.4 NPC1调节溶酶体后的胆固醇转运 | 第103-104页 |
| 4.2 Niemann-Picktype C (NPC)疾病 | 第104-105页 |
| 4.3 NPC1是Ebola病毒的受体 | 第105-106页 |
| 4.4 人源 NPC1蛋白及其同源蛋白的研究现状 | 第106-107页 |
| 本篇拟解决的问题 | 第107-109页 |
| 第五部分 实验材料与方法 | 第109-113页 |
| 5.1 基因克隆与质粒构建 | 第109-111页 |
| 5.1.1 目的基因的克隆 | 第109页 |
| 5.1.2 目的基因回收、双酶切及载体连接 | 第109-110页 |
| 5.1.3 连接产物转化 | 第110页 |
| 5.1.4 目的片段PCR鉴定 | 第110页 |
| 5.1.5 Pichia感受态的制备 | 第110页 |
| 5.1.6 电转Pichia酵母细胞 | 第110-111页 |
| 5.2 Pichia酵母诱导表达 | 第111-112页 |
| 5.3 蛋白质的晶体生长 | 第112-113页 |
| 第六部分 实验结果与讨论 | 第113-120页 |
| 6.1 TlNPC1蛋白克隆 | 第113页 |
| 6.2 NPC1的筛选及TlNPC1在DDM下的纯化结晶 | 第113-114页 |
| 6.3 TlNPC1蛋白的优化 | 第114-120页 |
| 6.3.1 TlNPC1蛋白的稳定性检测 | 第114-115页 |
| 6.3.2 TlNPC1蛋白的去垢剂筛选 | 第115页 |
| 6.3.3 TlNPC1蛋白的片段优化 | 第115-116页 |
| 6.3.4 TlNPC1蛋白去糖基化及蛋白酶解 | 第116-119页 |
| 6.3.5 不同课题组解析的NPC1及与其它蛋白的复合物结构 | 第119-120页 |
| 本篇讨论 | 第120-121页 |
| 参考文献 | 第121-127页 |
| 致谢 | 第127-128页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第128页 |
