| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 英文缩略表 | 第8-9页 |
| 目录 | 第9-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-25页 |
| 1 植酸酶的研究进展 | 第11-17页 |
| ·植酸酶的来源和性质 | 第11-13页 |
| ·植酸酶的基因及其蛋白结构 | 第13-14页 |
| ·植酸酶的催化机制 | 第14-16页 |
| ·植酸酶基因工程与蛋白质工程 | 第16-17页 |
| 2 毕赤酵母表达系统 | 第17-20页 |
| ·毕赤酵母表达系统的组成 | 第17-19页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第17-19页 |
| ·毕赤酵母受体菌 | 第19页 |
| ·毕赤酵母表达系统的特点 | 第19-20页 |
| 3 糖生物学研究进展 | 第20-24页 |
| ·糖基化修饰的分类和机制 | 第20-22页 |
| ·蛋白质糖基化修饰的研究方法 | 第22-23页 |
| ·植酸酶蛋白的糖基化研究 | 第23-24页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第24-25页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第25-40页 |
| 1 实验材料 | 第25-27页 |
| ·菌株与质粒 | 第25页 |
| ·引物合成和测序 | 第25页 |
| ·试剂盒、工具酶和生化试剂 | 第25页 |
| ·溶液 | 第25-26页 |
| ·培养基 | 第26页 |
| ·实验仪器 | 第26-27页 |
| 2 实验方法 | 第27-40页 |
| ·phyA2植酸酶N糖基化位点预测及其确认 | 第27页 |
| ·植酸酶phyA2基因的定点突变 | 第27-30页 |
| ·突变引物的设计 | 第27页 |
| ·突变基因PCR扩增 | 第27-29页 |
| ·回收产物与克隆载体的连接 | 第29-30页 |
| ·连接体系的转化 | 第30页 |
| ·重组克隆的筛选及其测序 | 第30页 |
| ·突变基因真核表达载体构建 | 第30-32页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第30-31页 |
| ·目的基因与载体的限制性内切酶处理 | 第31页 |
| ·目的基因与载体pPIC9连接反应 | 第31-32页 |
| ·重组表达载体的鉴定及其测序 | 第32页 |
| ·植酸酶活性的测定 | 第32-33页 |
| ·突变phyA2基因在毕赤酵母中的表达 | 第33-36页 |
| ·重组表达载体的线性化 | 第33-34页 |
| ·毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第34页 |
| ·线性化重组质粒的电击转化 | 第34-35页 |
| ·转化子的筛选 | 第35页 |
| ·重组酵母在发酵罐水平上的诱导表达 | 第35-36页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE检测和Western-blotting免疫印记分析 | 第36-37页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE检测 | 第36页 |
| ·表达产物的Western-blotting免疫印记分析 | 第36-37页 |
| ·野生型与突变植酸酶酶学性质的研究 | 第37-40页 |
| ·野生型与突变植酸酶最适温度与热稳定性的测定 | 第37页 |
| ·野生型与突变植酸酶最适pH与pH稳定性的测定 | 第37-38页 |
| ·金属离子及相关化学试剂对酶活的影响 | 第38页 |
| ·野生型与突变植酸酶比活的测定 | 第38-39页 |
| ·野生型与突变植酸酶的Km和Vmax的测定 | 第39-40页 |
| 第三章 实验结果 | 第40-52页 |
| 1 植酸酶phyA2糖基化位点预测及其确认 | 第40-41页 |
| 2 植酸酶phyA2基因的定点突变 | 第41-42页 |
| 3 突变基因真核表达载体构建 | 第42-44页 |
| ·真核表达载体构建过程 | 第42页 |
| ·真核表达载体的鉴定 | 第42-44页 |
| 4 植酸酶活性的测定 | 第44页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第44页 |
| 5 突变体植酸酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第44-46页 |
| ·线性化质粒电击转化毕赤酵母 | 第44-45页 |
| ·具有植酸酶活性的转化子的筛选 | 第45页 |
| ·重组毕赤酵母在发酵罐水平的诱导表达 | 第45页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE检测和Western-blotting免疫印记分析 | 第45-46页 |
| 6 野生型及其突变体植酸酶酶学性质的研究 | 第46-52页 |
| ·野生型及其突变体植酸酶的最适温度 | 第46-47页 |
| ·野生型及其突变体植酸酶的热稳定性研究 | 第47-48页 |
| ·野生型与突变体植酸酶的最适pH值 | 第48-49页 |
| ·野生型及其突变体植酸酶的pH稳定性研究 | 第49页 |
| ·金属离子及相关化学试剂对野生型及其突变体酶活的影响 | 第49-50页 |
| ·野生型及其突变体植酸酶比活的测定 | 第50-51页 |
| ·野生型及其突变体植酸酶Km和Vmax的测定 | 第51-52页 |
| 第四章 讨论 | 第52-55页 |
| 第五章 结论 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-64页 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
