| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩略语表 | 第12-16页 |
| 本论文所用病毒缩写及中英文对照 | 第16-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-51页 |
| 1. HC-Pro蛋白 | 第18-31页 |
| ·HC-Pro蛋白的结构 | 第18-21页 |
| ·HC-Pro蛋白的功能 | 第21-31页 |
| ·HC-Pro的蛋白酶功能 | 第21-22页 |
| ·HC-Pro在介体传毒中的作用 | 第22-25页 |
| ·HC-Pro在病毒细胞间运动及长距离运输中的作用 | 第25-26页 |
| ·HC-Pro参与病毒复制及症状表现 | 第26-27页 |
| ·HC-Pro抑制植物的基因沉默 | 第27-31页 |
| 2. 病毒与寄主相互作用的研究方法及其在Potyvirus属病毒研究中的应用 | 第31-43页 |
| ·转基因 | 第31-32页 |
| ·全长侵染性克隆 | 第32-33页 |
| ·蛋白质定位分析 | 第33-36页 |
| ·免疫胶体金定位 | 第33-34页 |
| ·免疫荧光技术 | 第34页 |
| ·GFP及其突变体在定位中的应用 | 第34-36页 |
| ·免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP) | 第36页 |
| ·酵母双杂交系统 | 第36-39页 |
| ·双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC) | 第39-40页 |
| ·串联亲和纯化技术(Tandem affinity purification,TAP) | 第40-42页 |
| ·其他技术与方法 | 第42-43页 |
| 3. 病毒诱导的基因沉默 | 第43-50页 |
| ·VIGS载体类型 | 第45-48页 |
| ·RNA病毒载体 | 第45-47页 |
| ·DNA病毒载体 | 第47-48页 |
| ·卫星病毒和卫星DNA载体 | 第48页 |
| ·VIGS载体研究基因功能的优点和局限性 | 第48-50页 |
| ·VIGS载体研究基因功能的优点 | 第48-49页 |
| ·VIGS载体研究基因功能的局限性 | 第49-50页 |
| 4 本研究的目的与内容 | 第50-51页 |
| 第二章 HC-Pro蛋白的表达和抑制子功能鉴定 | 第51-69页 |
| 1 材料与方法 | 第51-62页 |
| ·实验材料 | 第51-52页 |
| ·毒源与植物材料 | 第51页 |
| ·菌株与载体质粒 | 第51-52页 |
| ·试剂和仪器 | 第52页 |
| ·试剂 | 第52页 |
| ·仪器 | 第52页 |
| ·实验方法 | 第52-62页 |
| ·摩擦接种 | 第52-53页 |
| ·电子显微镜观察 | 第53页 |
| ·RNA抽提 | 第53-55页 |
| ·逆转录 | 第55页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR) | 第55-56页 |
| ·5'-RACE | 第56-57页 |
| ·DNA片段切胶纯化 | 第57页 |
| ·T-A连接 | 第57-58页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备(CaCl_2法) | 第58页 |
| ·转化和筛选 | 第58页 |
| ·质粒提取 | 第58-59页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第59页 |
| ·序列测定和分析 | 第59页 |
| ·感受态农杆菌的制备 | 第59页 |
| ·电击转化感受态农杆菌 | 第59-60页 |
| ·携带GFP的TuMV-UK1双元表达载体构建 | 第60页 |
| ·HC-Pro蛋白在PVX载体中的表达 | 第60-61页 |
| ·HC-Pro沉默抑制功能的鉴定 | 第61-62页 |
| 2 结果与分析 | 第62-67页 |
| ·不同形式的TuMV-UK1侵染性克隆致病性存在差异 | 第62-64页 |
| ·TuMV-UK1分离物的病毒粒子形态和细胞病理学特征 | 第64-65页 |
| ·HC-Pro是基因沉默的抑制子 | 第65-66页 |
| ·HC-Pro在PVX载体中表达增强病毒的致病性 | 第66-67页 |
| 3 讨论 | 第67-69页 |
| 第三章 TuMV HC-Pro蛋白的定位及自身相互作用 | 第69-89页 |
| 1 材料与方法 | 第69-77页 |
| ·材料 | 第69-70页 |
| ·质粒和菌株 | 第69-70页 |
| ·主要试剂 | 第70页 |
| ·方法 | 第70-77页 |
| ·常规分子生物学方法 | 第70-71页 |
| ·酵母双杂交基本操作 | 第71-73页 |
| ·HC-Pro及其突变体酵母双杂交载体的构建 | 第73-74页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第74-75页 |
| ·农杆菌浸润烟草组织 | 第75页 |
| ·原生质体的制备 | 第75-76页 |
| ·TuMV HC-Pro在昆虫细胞中的定位和相互作用 | 第76-77页 |
| ·共聚焦显微观察 | 第77页 |
| 2 结果与分析 | 第77-86页 |
| ·TuMV HC-Pro蛋白自身相互作用研究 | 第77-80页 |
| ·酵母双杂交检测HC-Pro蛋白的自身互作 | 第77页 |
| ·双分子荧光互补检测HC-Pro蛋白在寄主体内的相互作用 | 第77-78页 |
| ·双分子荧光互补检测HC-Pro蛋白在昆虫细胞中的相互作用 | 第78-80页 |
| ·TuMV HC-Pro蛋白自身相互作用功能区的分析 | 第80-83页 |
| ·YTH鉴定TuMV HC-Pro蛋白自身相互作用功能区的分析 | 第80-82页 |
| ·BiFC鉴定TuMV HC-Pro蛋白自身相互作用功能区的分析 | 第82-83页 |
| ·TuMV HC-Pro蛋白的亚细胞定位 | 第83-86页 |
| ·TuMV HC-Pro蛋白在烟草表皮细胞和原生质体中的定位 | 第83页 |
| ·TuMV HC-Pro蛋白突变体在烟草表皮细胞中的定位 | 第83-85页 |
| ·TuMV HC-Pro蛋白在昆虫细胞中的定位 | 第85-86页 |
| 3 讨论 | 第86-89页 |
| 第四章 TuMV HC-Pro与拟南芥Rieske Fe/S蛋白的相互作用 | 第89-113页 |
| 1 材料与方法 | 第90-96页 |
| ·材料 | 第90-91页 |
| ·植物材料 | 第90-91页 |
| ·菌株 | 第91页 |
| ·病毒载体 | 第91页 |
| ·方法 | 第91-96页 |
| ·常规分子生物学方法 | 第91页 |
| ·酵母双杂交基本操作 | 第91页 |
| ·酵母双杂交载体的构建 | 第91-92页 |
| ·构建植物表达载体 | 第92-94页 |
| ·农杆菌浸润烟草组织 | 第94页 |
| ·共聚焦显微观察 | 第94页 |
| ·病毒诱导的Pet C基因沉默 | 第94-95页 |
| ·病毒诱导的Pet C基因沉默效率半定量检测 | 第95-96页 |
| 2 结果与分析 | 第96-110页 |
| ·Rieske Fe/S蛋白结构分析 | 第96-97页 |
| ·TuMV HC-Pro蛋白与Rieske Fe/S蛋白相互作用研究 | 第97-100页 |
| ·酵母双杂交检测TuMV HC-Pro蛋白与Rieske Fe/S蛋白的互作 | 第97-99页 |
| ·BiFC检测TuMV HC-Pro蛋白与Rieske Fe/S蛋白的互作 | 第99-100页 |
| ·TuMV HC-Pro蛋白对Rieske Fe/S蛋白定位影响的研究 | 第100-102页 |
| ·Rieske Fe/S蛋白的亚细胞定位 | 第100-101页 |
| ·HC-Pro蛋白对Rieske Fe/S蛋白的亚细胞定位的影响 | 第101-102页 |
| ·TRV介导的Pet C基因在拟南芥上的沉默 | 第102-107页 |
| ·沉默载体的构建 | 第102-103页 |
| ·Pet C基因沉默后拟南芥植株表型分析 | 第103-106页 |
| ·沉默后Pet C基因的半定量RT-PCR水平分析 | 第106-107页 |
| ·TRV介导的Pet C基因沉默的烟草植株表型分析 | 第107-108页 |
| ·PVX介导的Pet C基因沉默的烟草植株的表型分析 | 第108-110页 |
| 3 讨论 | 第110-113页 |
| 第五章 全文总结与展望 | 第113-116页 |
| 1 主要结论 | 第113-115页 |
| 2 展望 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-129页 |
| 附录1 主要试剂及溶液的配制 | 第129-133页 |
| 附录2 目的基因序列 | 第133-134页 |
| 附录3 在读期间论文发表情况 | 第134-135页 |
| 致谢 | 第135页 |
