| 摘要 | 第3-6页 |
| AbsTract | 第6-8页 |
| 第1章 绪论 | 第13-29页 |
| 1.1 蛇毒丝氨酸蛋白酶概述 | 第13-14页 |
| 1.2 蛇毒类凝血酶概述 | 第14-20页 |
| 1.2.1 SVTLEs的结构 | 第15-16页 |
| 1.2.2 SVTLEs的理化性质 | 第16-17页 |
| 1.2.3 SVTLEs的药理学作用 | 第17-18页 |
| 1.2.4 SVTLEs的作用机制 | 第18-19页 |
| 1.2.5 SVTLEs的应用 | 第19-20页 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第20-25页 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统的基本体系 | 第20-23页 |
| 1.3.2 影响外源蛋白表达的因素 | 第23-25页 |
| 1.4 基因工程技术重组表达SVTLEs | 第25-27页 |
| 1.4.1 SVTLEs的原核表达 | 第26页 |
| 1.4.2 SVTLEs的真核表达 | 第26-27页 |
| 1.5 本文的选题依据及研究内容 | 第27-29页 |
| 第2章 基因序列的生物信息学分析及密码子优化 | 第29-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-30页 |
| 2.2.1 生物信息学分析 | 第29页 |
| 2.2.2 毕赤酵母密码子偏爱性分析 | 第29页 |
| 2.2.3 密码子优化 | 第29-30页 |
| 2.3 实验结果 | 第30-37页 |
| 2.3.1 基因及氨基酸序列分析 | 第30页 |
| 2.3.2 氨基酸序列同源性分析 | 第30-31页 |
| 2.3.3 毕赤酵母密码子偏爱性分析结果 | 第31-32页 |
| 2.3.4 密码子优化结果 | 第32-37页 |
| 第3章 真核表达载体的构建 | 第37-45页 |
| 3.1 实验材料 | 第37-38页 |
| 3.1.1 实验菌株及载体 | 第37页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第37页 |
| 3.1.3 主要实验试剂 | 第37-38页 |
| 3.2 实验方法 | 第38-42页 |
| 3.2.1 目的基因与引物的合成 | 第38页 |
| 3.2.2 目的基因mIntobin1和mIntobin2的获得 | 第38-39页 |
| 3.2.3 pPIC9K载体的获得 | 第39页 |
| 3.2.4 目的基因与表达载体双酶切 | 第39页 |
| 3.2.5 目的基因与载体连接 | 第39-40页 |
| 3.2.6 TOP10感受态细胞的制备 | 第40页 |
| 3.2.7 重组质粒的转化 | 第40页 |
| 3.2.8 质粒DNA的提取 | 第40-41页 |
| 3.2.9 重组载体的鉴定 | 第41-42页 |
| 3.3 实验结果 | 第42-45页 |
| 3.3.1 目的基因的PCR扩增 | 第42-43页 |
| 3.3.2 pPIC9K载体双酶切 | 第43页 |
| 3.3.3 重组载体的鉴定 | 第43-45页 |
| 第4章 重组载体电转化入毕赤酵母及高抗性转化子的筛选及阳性克隆的鉴定 | 第45-57页 |
| 4.1 实验材料 | 第45页 |
| 4.1.1 实验菌种和载体 | 第45页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第45页 |
| 4.1.3 实验主要试剂 | 第45页 |
| 4.2 实验方法 | 第45-50页 |
| 4.2.1 重组载体线性化 | 第45-46页 |
| 4.2.2 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备 | 第46页 |
| 4.2.3 重组质粒的电转化 | 第46-47页 |
| 4.2.4 重组菌株的筛选与鉴定 | 第47页 |
| 4.2.5 阳性克隆的鉴定 | 第47-48页 |
| 4.2.6 目的蛋白的初步诱导表达 | 第48-49页 |
| 4.2.7 SDS-PAGE初步检测目的蛋白 | 第49-50页 |
| 4.2.8 目的蛋白的WesteRN-blot鉴定 | 第50页 |
| 4.3 实验结果 | 第50-57页 |
| 4.3.1 重组载体线性化 | 第50-51页 |
| 4.3.2 重组载体电转入GS115 | 第51-52页 |
| 4.3.3 高抗性转化子的筛选 | 第52-53页 |
| 4.3.4 高抗性转化子整型鉴定 | 第53页 |
| 4.3.5 高抗性转化子基因组DNA的鉴定 | 第53-54页 |
| 4.3.6 SDS-PAGE初步鉴定目的蛋白 | 第54-55页 |
| 4.3.7 WesteRN-blot鉴定 | 第55-57页 |
| 第5章 重组蛋白发酵条件优化及其纯化 | 第57-67页 |
| 5.1 实验材料 | 第57页 |
| 5.1.1 菌株 | 第57页 |
| 5.1.2 实验仪器 | 第57页 |
| 5.1.3 实验试剂 | 第57页 |
| 5.2 实验方法 | 第57-60页 |
| 5.2.1 Bradford法测定蛋白浓度 | 第57页 |
| 5.2.2 发酵条件的优化 | 第57-59页 |
| 5.2.3 重组蛋白的纯化 | 第59页 |
| 5.2.4 目的蛋白的定量分析 | 第59-60页 |
| 5.3 实验结果 | 第60-67页 |
| 5.3.1 Bradford法测定蛋白浓度 | 第60页 |
| 5.3.2 发酵条件优化 | 第60-64页 |
| 5.3.3 重组蛋白的纯化 | 第64页 |
| 5.3.4 目的蛋白的定量分析 | 第64-67页 |
| 第6章 重组蛋白的生物学活性检测 | 第67-71页 |
| 6.1 实验材料 | 第67页 |
| 6.2 实验仪器 | 第67页 |
| 6.3 实验试剂 | 第67页 |
| 6.4 实验方法 | 第67-68页 |
| 6.4.1 酰胺水解活性的测定 | 第67页 |
| 6.4.2 纤溶活性测定 | 第67-68页 |
| 6.4.3 纤维蛋白原水解活性测定 | 第68页 |
| 6.5 结果 | 第68-71页 |
| 6.5.1 酰胺水解活性的测定 | 第68页 |
| 6.5.2 纤溶活性测定 | 第68-69页 |
| 6.5.3 纤维蛋白原水解活性的测定 | 第69-71页 |
| 第7章 讨论 | 第71-75页 |
| 7.1 密码子优化 | 第71页 |
| 7.2 mIntobin1/ mIntobin2在毕赤酵母中的分泌表达 | 第71-72页 |
| 7.3 发酵条件优化及纯化情况 | 第72-73页 |
| 7.4 相关活性的探讨 | 第73-75页 |
| 第8章 结论 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-87页 |
| 附录 | 第87-93页 |
| 致谢 | 第93-95页 |
| 攻读硕士期间研究成果 | 第95页 |
