| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-19页 |
| 1 蛋白药物 | 第10页 |
| 2 蛋白药物长效化 | 第10-14页 |
| 2.1 蛋白药物的缺点 | 第10-11页 |
| 2.2 PEG修饰 | 第11-12页 |
| 2.3 融合蛋白修饰 | 第12页 |
| 2.4 糖基化修饰 | 第12-13页 |
| 2.5 脂肪酸修饰 | 第13-14页 |
| 3 传统脂肪酸修饰与合成编码非天然氨基酸技术修饰 | 第14-16页 |
| 3.1 传统脂肪酸修饰技术 | 第14页 |
| 3.2 合成编码非天然氨基酸技术及其在脂肪酸修饰上的应用 | 第14-16页 |
| 4 研究的目的及意义 | 第16-17页 |
| 5 技术路线 | 第17-18页 |
| 6 筛选方案 | 第18-19页 |
| 第二章 材料和方法 | 第19-64页 |
| 1 实验材料 | 第19-26页 |
| 1.1 非天然氨基酸HepoK | 第19页 |
| 1.2 主要菌株与质粒 | 第19页 |
| 1.3 C57BL/6J小鼠 | 第19-20页 |
| 1.4 主要实验试剂与耗材 | 第20-22页 |
| 1.5 实验仪器设备 | 第22-23页 |
| 1.6 主要溶液的配制 | 第23-25页 |
| 1.7 引物的设计与合成 | 第25-26页 |
| 2 实验方法 | 第26-64页 |
| 2.1 DH10B电感受态的制备以及转化效率的检测 | 第26-27页 |
| 2.2 化学感受态的化学转化以及电感受态的电转化 | 第27页 |
| 2.3 TK库质粒的扩增 | 第27-28页 |
| 2.4 DH10B对NaOH的耐受实验 | 第28页 |
| 2.5 DH10B(含pREP质粒)电感受态的制备以及转化效率的检测 | 第28-29页 |
| 2.6 筛选能特异性识别和利用HepoK的氨酰tRNA合成酶(RS) | 第29-30页 |
| 2.7 通过与pTAK-GFP-TAG182共转,来验证HepoKRS的有效性和特异性 | 第30页 |
| 2.8 通过与pTAK-Myoglobin-4TAG共转,来验证HepoKRS的有效性和特异性 | 第30-32页 |
| 2.9 构建pUC57-FGF21(WT) | 第32-33页 |
| 2.10 构建pTAK-FGF21-his6(WT)和pTAK-FGF21-his6(Mut) | 第33-36页 |
| 2.11 构建pET26b-FGF21-his6(WT)和pET26b-FGF21-his6-131TAG(Mut) | 第36-38页 |
| 2.12 构建pESUMO-LIT(WT)和pESUMO-LIT(Mut) | 第38-39页 |
| 2.13 构建pET26b-SUMO-LIT-his6(WT)和pET26b-SUMO-LIT-his6(Mut) | 第39-42页 |
| 2.14 构建pEVOL-HepoKRS | 第42-44页 |
| 2.15 构建pEVOL-dHepoKRS | 第44-45页 |
| 2.16 验证pEVOL-HepoKRS和pEVOL-dHepoKRS的有效性 | 第45-46页 |
| 2.17 纯化FGF21-WT蛋白 | 第46-48页 |
| 2.18 纯化FGF21-HepoK蛋白 | 第48-52页 |
| 2.19 Fortibio检测FGF21-his6(Mut/WT)与HSA的相互作用力 | 第52-55页 |
| 2.20 纯化SUMO-Protease蛋白 | 第55-56页 |
| 2.21 纯化LIT-WT蛋白 | 第56-58页 |
| 2.22 纯化LIT-HepoK蛋白 | 第58-60页 |
| 2.23 Fortibio检测LIT-his6(Mut/WT)与HSA的相互作用力 | 第60-63页 |
| 2.24 比较LIT-WT与LIT-HepoK在动物体内的代谢速率(IPGTT实验) | 第63-64页 |
| 第三章 实验结果 | 第64-107页 |
| 1 DH10B电转感受态的转化效率 | 第64页 |
| 2 TK库质粒扩增 | 第64页 |
| 3 DH10B对不同浓度NaOH的耐受性 | 第64-65页 |
| 4 DH10B(pREP)电转感受态的转化效率 | 第65页 |
| 5 筛选能特异性识别和利用UAA的氨酰tRNA合成酶(RS) | 第65-72页 |
| 5.1 第一轮筛选结果 | 第65-67页 |
| 5.2 第二轮筛选结果 | 第67-69页 |
| 5.3 第三轮筛选结果 | 第69-71页 |
| 5.4 核酸及氨基酸序列比对结果 | 第71-72页 |
| 5.5 获取pBK-HepoKRS质粒 | 第72页 |
| 6 验证HepoKRS的有效性和特异性 | 第72-75页 |
| 6.1 通过GFP的发光指示,来验证pBK-HepoKRS的有效性和特异性 | 第72-73页 |
| 6.2 通过考染及Western Blot实验，观察肌红蛋白（Myoglobin）的表达情况，来验证pBK-HepoKRS的特异有效性 | 第73-74页 |
| 6.3 通过质谱检测Myoglobin-HepoK,来验证pBK-HepoKRS的有效性和特异性 | 第74-75页 |
| 7 FGF21-WT的表达及纯化 | 第75-82页 |
| 7.1 重组质粒的构建及鉴定 | 第75-77页 |
| 7.2 小量表达FGF21-WT蛋白 | 第77-78页 |
| 7.3 比较温度对可溶性FGF21-WT表达的影响 | 第78-79页 |
| 7.4 大量诱导和纯化FGF21-WT | 第79-82页 |
| 8 FGF21-HepoK的表达及纯化 | 第82-91页 |
| 8.1 重组质粒的构建及鉴定 | 第82-85页 |
| 8.2 验证pEVOL-HepoKRS和pEVOL-dHepoKRS的有效性 | 第85-86页 |
| 8.3 比较pEVOL-HepoKRS和pEVOL-dHepoKRS在FGF21表达能力上的差异 | 第86-88页 |
| 8.4 大量诱导和纯化FGF21-HepoK | 第88-91页 |
| 9 Fortibio检测比较FGF21-WT和FGF21-HepoK与HSA的相互作用 | 第91-92页 |
| 10 SUMO-Protease的表达及纯化 | 第92-94页 |
| 11 Lit-WT的表达及纯化 | 第94-100页 |
| 11.1 重组质粒的构建及鉴定 | 第94-97页 |
| 11.2 小量表达SUMO-LIT-WT | 第97页 |
| 11.3 大量诱导和纯化LIT-WT | 第97-100页 |
| 12 LIT-HepoK的表达及纯化 | 第100-105页 |
| 12.1 重组质粒的构建及鉴定 | 第100-102页 |
| 12.2 大量诱导和纯化LIT-HepoK | 第102-105页 |
| 13 Fortibio检测比较LIT-WT和LIT-HepoK与HSA的相互作用 | 第105页 |
| 14 比较LIT-WT和LIT-HepoK在动物体内的代谢速率(IPGTT实验) | 第105-107页 |
| 第四章 讨论 | 第107-109页 |
| 第五章 结论 | 第109-110页 |
| 参考文献 | 第110-117页 |
| 攻读学位期间的成果 | 第117-118页 |
| 致谢 | 第118页 |
