| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 主要缩略词 | 第16-17页 |
| 第1章 绪论 | 第17-27页 |
| 1.1 CRISPR-Cas的发现 | 第17页 |
| 1.2 CRISPR基本结构 | 第17-18页 |
| 1.3 CRISPR-Cas系统分类 | 第18-19页 |
| 1.3.1 Ⅰ型CRISPR系统 | 第19页 |
| 1.3.2 Ⅱ型CRISPR系统 | 第19页 |
| 1.3.3 Ⅲ型CRISPR系统 | 第19页 |
| 1.4 作用原理 | 第19-22页 |
| 1.4.1 Cas蛋白家族和功能模块 | 第20页 |
| 1.4.2 Cas9作用机制 | 第20-22页 |
| 1.4.2.1 Cas9适应性免疫机制 | 第20-21页 |
| 1.4.2.2 Cas9靶向切割机制 | 第21-22页 |
| 1.5 基因编辑技术 | 第22-24页 |
| 1.5.1 编程酶概况 | 第22-23页 |
| 1.5.2 编程酶发展 | 第23-24页 |
| 1.5.3 基因编辑的作用与意义 | 第24页 |
| 1.6 温敏突变 | 第24-25页 |
| 1.6.1 传统构建方法 | 第24-25页 |
| 1.6.2 位点预测方法 | 第25页 |
| 1.7 本研究的目的与意义 | 第25-27页 |
| 第2章 材料与方法 | 第27-41页 |
| 2.1 材料 | 第27-30页 |
| 2.1.1 菌株 | 第27页 |
| 2.1.2 质粒 | 第27页 |
| 2.1.3 培养基 | 第27-28页 |
| 2.1.4 试剂药品 | 第28页 |
| 2.1.4.1 试剂 | 第28页 |
| 2.1.4.2 酶 | 第28页 |
| 2.1.4.3 试剂盒 | 第28页 |
| 2.1.5 仪器及相关设备 | 第28页 |
| 2.1.6 实验室主要溶液及配制方法 | 第28-30页 |
| 2.1.6.1 碱裂解法提取质粒所用溶液的配制 | 第28-29页 |
| 2.1.6.2 琼脂糖凝胶电泳所用试剂的配制 | 第29页 |
| 2.1.6.3 SDS-PAGE电泳缓冲液配制 | 第29页 |
| 2.1.6.4 Cas9相关缓冲液配制 | 第29-30页 |
| 2.1.6.5 其他溶液的配制 | 第30页 |
| 2.2 方法 | 第30-41页 |
| 2.2.1 PCR反应体系 | 第30-31页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳回收纯化DNA片段 | 第31页 |
| 2.2.3 T5核酸外切酶介导的无酶克隆 | 第31页 |
| 2.2.4 大肠杆菌转化方法及质粒抽提操作 | 第31页 |
| 2.2.5 Cas9酶的表达单元的构建 | 第31-33页 |
| 2.2.7 Cas9基因在大肠杆菌中摇瓶诱导表达 | 第33页 |
| 2.2.8 Cas9蛋白的纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质 | 第34-35页 |
| 2.2.10 Bradford法测定蛋白质浓度 | 第35页 |
| 2.2.11 RNA的体外转录 | 第35-36页 |
| 2.2.11.1 体外转录RNA的原理 | 第35页 |
| 2.2.11.2 体外转录RNA的操作步骤 | 第35-36页 |
| 2.2.12 Cas9酶切体系 | 第36页 |
| 2.2.13 Cas9可突变位点预测 | 第36-39页 |
| 2.2.13.1 TSpred输入界面 | 第36-37页 |
| 2.2.13.2 TSpred预测策略及疏水性预测 | 第37-38页 |
| 2.2.13.3 预测包埋在内的氨基酸残基 | 第38页 |
| 2.2.13.4 预测标准 | 第38-39页 |
| 2.2.14 Cas9突变体的构建方法 | 第39-41页 |
| 第3章 结果与分析 | 第41-58页 |
| 3.1 Cas9酶基因的表达单元的构建 | 第41-42页 |
| 3.2 Cas9酶在大肠杆菌中的摇瓶诱导表达、纯化、鉴定及蛋白浓度检测 | 第42-45页 |
| 3.2.1 Cas9酶在大肠杆菌中的摇瓶诱导表达 | 第42-43页 |
| 3.2.2 SDS-PAGE分析Cas9酶的表达及纯化情况 | 第43-44页 |
| 3.2.3 Cas9酶蛋白的浓度测定 | 第44-45页 |
| 3.3 Cas9可突变位点预测结果 | 第45-46页 |
| 3.4 RNA的体外转录 | 第46页 |
| 3.5 单条sgRNA引导Cas9酶对靶质粒的单位点酶切 | 第46-47页 |
| 3.6 两条sgRNA引导Cas9酶对靶质粒的双位点酶切 | 第47-49页 |
| 3.7 Cas9突变体的表达 | 第49页 |
| 3.8 野生Cas9热稳定性验证 | 第49-50页 |
| 3.9 Cas9突变体热稳定性探究 | 第50-56页 |
| 3.10 酶切效果的比较 | 第56-58页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第58-60页 |
| 4.1 讨论 | 第58页 |
| 4.2 展望 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
