| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词表 | 第10-15页 |
| 第一章 前言 | 第15-31页 |
| 1.1 p53及其异构体 | 第16-20页 |
| 1.1.1 p53,p53β和p53γ | 第17-18页 |
| 1.1.2 △40p53,△40p53β和△40p53γ | 第18-19页 |
| 1.1.3 △133p53,△133p53β和△133p53γ | 第19-20页 |
| 1.1.4 △160p53,△160p53β和△160p53γ | 第20页 |
| 1.1.5 △p53 | 第20页 |
| 1.2 人类半胱氨酸蛋白酶家族Calpains | 第20-21页 |
| 1.3 斑马鱼作为模式生物的优势 | 第21-22页 |
| 1.4 斑马鱼突变体构建技术 | 第22-27页 |
| 1.4.1 随机突变 | 第23-24页 |
| 1.4.2 定点突变 | 第24-27页 |
| 1.5 斑马鱼肝脏发育和肝脏疾病模型 | 第27-31页 |
| 1.5.1 斑马鱼肝脏发育过程 | 第27页 |
| 1.5.2 斑马鱼肝脏发育的分子调控机制 | 第27-29页 |
| 1.5.3 斑马鱼作为研究肝脏发育和疾病的模型 | 第29-31页 |
| 第二章 材料与方法 | 第31-59页 |
| 2.1 斑马鱼 | 第31页 |
| 2.1.1 斑马鱼品系及饲养 | 第31页 |
| 2.1.2 斑马鱼的交配及受精卵的收集 | 第31页 |
| 2.2 人类细胞系 | 第31-32页 |
| 2.2.1 细胞系的培养、传代和冻存 | 第31-32页 |
| 2.2.2 细胞转染 | 第32页 |
| 2.3 抗体 | 第32-33页 |
| 2.4 常用化学试剂及培养基 | 第33-35页 |
| 2.5 DNA相关操作方法 | 第35-41页 |
| 2.5.1 DNA片段克隆 | 第35-36页 |
| 2.5.2 DNA测序 | 第36-37页 |
| 2.5.3 质粒定点突变/特定片段的删除 | 第37页 |
| 2.5.4 两个DNA片段的无缝拼接 | 第37页 |
| 2.5.5 斑马鱼基因组DNA提取 | 第37-38页 |
| 2.5.6 Southern印记分析 | 第38-41页 |
| 2.5.7 斑马鱼细胞凋亡检测 | 第41页 |
| 2.6 RNA相关操作方法 | 第41-46页 |
| 2.6.1 斑马鱼胚胎或肝脏总RNA样品的提取 | 第42页 |
| 2.6.2 DNase I处理总RNA样品 | 第42页 |
| 2.6.3 总RNA样品中mRNA的分离纯化 | 第42页 |
| 2.6.4 两步法RT-PCR | 第42-43页 |
| 2.6.5 mRNA的体外合成 | 第43页 |
| 2.6.6 Northern印记分析 | 第43-44页 |
| 2.6.7 5 'RLM RACE | 第44页 |
| 2.6.8 斑马鱼整胚原位杂交(WISH) | 第44-46页 |
| 2.7 蛋白质相关操作方法 | 第46-50页 |
| 2.7.1 Western印记分析 | 第46-48页 |
| 2.7.2 抗体的制备 | 第48-49页 |
| 2.7.3 斑马鱼冷冻切片的免疫荧光染色 | 第49-50页 |
| 2.8 斑马鱼显微注射 | 第50-51页 |
| 2.8.1 显微注射样品的准备 | 第50页 |
| 2.8.2 显微注射毛细玻璃针管的准备 | 第50页 |
| 2.8.3 显微注射至卵黄中 | 第50页 |
| 2.8.4 显微注射至细胞中 | 第50-51页 |
| 2.9 苏木精和伊红染色(H&E,Hematoxylin and Eosin Staining) | 第51页 |
| 2.9.1 染色液的制备 | 第51页 |
| 2.9.2 冷冻切片的H&E染色 | 第51页 |
| 2.10 LBR(Liver/Body Weight Ratio)检测 | 第51-53页 |
| 2.11 本课题所用Morpholino、siRNA和引物的序列表 | 第53-59页 |
| 第三章 核仁蛋白Def和CAPN3b共同介导p53的降解 | 第59-66页 |
| 3.1 斑马鱼def~(hi429)突变体中p53蛋白增加 | 第59页 |
| 3.2 斑马鱼def~(hi429)突变体中增加的p53蛋白位于核仁 | 第59-60页 |
| 3.3 斑马鱼Def可以负调控p53 | 第60页 |
| 3.4 hu-Def通过CAPN3介导hu-p53蛋白降解 | 第60-63页 |
| 3.4.1 半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以阻断hu-Def对hu-p53的降解 | 第61页 |
| 3.4.2 hu-Def通过CAPN3介导hu-p53蛋白降解 | 第61-62页 |
| 3.4.3 hu-Def的敲低抑制CAPN3对hu-p53蛋白的体外降解 | 第62-63页 |
| 3.4.4 体外系统hu-Def不诱导p53降解也不影响CAPN3对hu-p53蛋白的降解 | 第63页 |
| 3.5 斑马鱼Def通过CAPN3b介导p53的降解 | 第63页 |
| 3.6 斑马鱼CAPN3b对p53的降解通过其半胱氨酸蛋白酶活性 | 第63-66页 |
| 第四章 CAPN3a/b抗体的制备及其突变体斑马鱼的构建 | 第66-71页 |
| 4.2 capn3a/b突变体斑马鱼的制备 | 第66-68页 |
| 4.2.1 capn3a/b TALEN质粒构建 | 第66页 |
| 4.2.2 capn3a/b TALEN显微注射及效率检测 | 第66-67页 |
| 4.2.3 capn3a/b突变体斑马鱼的筛选 | 第67-68页 |
| 4.3 小结与讨论 | 第68-71页 |
| 第五章 Def过表达转基因斑马鱼品系的建立 | 第71-77页 |
| 5.1 建立肝脏过表达Def转基因鱼品系Tg(fabp10a:def) | 第71-73页 |
| 5.1.1 肝脏过表达Def转基因鱼品系Tg(fabp10a:def)的构建 | 第71页 |
| 5.1.2 肝脏过表达Def转基因鱼品系Tg(fabp10a:def)的鉴定 | 第71-72页 |
| 5.1.3 Tg(fabp10a:def)中def mRNA及Def蛋白的检测 | 第72-73页 |
| 5.2 建立热激启动的Def转基因鱼品系Tg(eYFP:8xHSE:def) | 第73-75页 |
| 5.2.1 热激启动的Def转基因鱼品系Tg(eYFP:8xHSE:def)的构建 | 第74页 |
| 5.2.2 热激启动的Def转基因鱼品系Tg(eYFP:8xHSE:def)的鉴定 | 第74-75页 |
| 5.2.3 热激启动的Def转基因鱼品系Tg(eYFP:8xHSE:def)蛋白表达检测 | 第75页 |
| 5.3 小结与讨论 | 第75-77页 |
| 第六章 持续性高表达Def对斑马鱼肝脏的影响 | 第77-91页 |
| 6.1 Tg-I可以特异性的拯救def~(hi429)突变体内的小肝脏表型 | 第77页 |
| 6.2 Tg-I中过表达的Def使斑马鱼成鱼的肝脏变小 | 第77页 |
| 6.3 Tg-I成鱼肝脏中18S rRNA前体大量积累 | 第77-80页 |
| 6.4 Tg-I成鱼肝脏中p53不降反升 | 第80页 |
| 6.5 Tg-I成鱼肝脏基因表达谱分析 | 第80-84页 |
| 6.5.1 Tg-I中表达差异基因的分类统计 | 第81页 |
| 6.5.2 Tg-I中有一些通路中的部分基因表达发生显著变化 | 第81-84页 |
| 6.6 Def的过表达导致了成鱼肝脏的病变 | 第84-87页 |
| 6.7 Def的过表达增加了肝脏肿瘤的易感性 | 第87-89页 |
| 6.8 小结与讨论 | 第89-91页 |
| 第七章 新的p53异构体的鉴定 | 第91-101页 |
| 7.1 斑马鱼def~(hi429)突变体中表达未知p53异构体 | 第91页 |
| 7.2 找到一个C端提前终止的p53异构体 | 第91-92页 |
| 7.3 △113~bp53的鉴定 | 第92-97页 |
| 7.4 基因组DNA 4个碱基缺失导致产生△113~bp53 | 第97-98页 |
| 7.5 小结与讨论 | 第98-101页 |
| 第八章 △113~bp53生物学功能初步研究 | 第101-105页 |
| 8.1 △113~bp53与△113p53共用一个启动子 | 第101-102页 |
| 8.2 △113~bp53生物学功能初步研究 | 第102-104页 |
| 8.2.1 △113~bp53能降低p53引起的高死亡率 | 第102页 |
| 8.2.2 △113~bp53能拮抗p53引起的凋亡 | 第102-104页 |
| 8.3 小结与讨论 | 第104-105页 |
| 第九章 结论与讨论 | 第105-109页 |
| 9.1 结论 | 第105-106页 |
| 9.2 讨论 | 第106-109页 |
| 参考文献 | 第109-119页 |
| 作者简介 | 第119-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
