| 中文摘要 | 第17-20页 |
| Abstract | 第20-23页 |
| 符号说明及缩写词 | 第24-26页 |
| 第一章 文献综述 | 第26-46页 |
| 1.1 粘细菌简介 | 第26-32页 |
| 1.1.1 粘细菌的的典型特征及分类 | 第26-27页 |
| 1.1.2 纤维堆囊菌及其次级代谢产物 | 第27-28页 |
| 1.1.3 黄色粘球菌及其次级代谢产物 | 第28-32页 |
| 1.2 埃博霉素的生物合成及研究现状 | 第32-39页 |
| 1.2.1 埃博霉素及其合成途径 | 第32-34页 |
| 1.2.2 埃博霉素的异源表达研究 | 第34-37页 |
| 1.2.3 埃博霉素异源表达菌株的发酵优化和遗传改造研究 | 第37-39页 |
| 1.3 原核生物的转录调控 | 第39-44页 |
| 1.3.1 原核生物转录调控概述 | 第39-41页 |
| 1.3.2 转录调控因子的鉴定及分离方法 | 第41-43页 |
| 1.3.3 粘细菌中次级代谢转录调控因子的研究进展 | 第43-44页 |
| 1.4 本文工作开展思路及研究内容 | 第44-46页 |
| 第二章 埃博霉素异源表达菌株ZE菌发酵条件的初步优化 | 第46-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第46-47页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第46页 |
| 2.1.2 培养基 | 第46-47页 |
| 2.1.3 主要实验试剂 | 第47页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第47页 |
| 2.1.5 软件工具 | 第47页 |
| 2.2 实验方法 | 第47-51页 |
| 2.2.1 埃博霉素异源表达菌株ZE菌的发酵 | 第47-48页 |
| 2.2.1.1 吸附树脂的预处理 | 第47-48页 |
| 2.2.1.2 ZE菌株的发酵 | 第48页 |
| 2.2.2 埃博霉素的检测与分析 | 第48页 |
| 2.2.3 埃博霉素异源表达菌株生长曲线的测定 | 第48-49页 |
| 2.2.4 埃博霉素生物合成基因簇的转录水平检测 | 第49-51页 |
| 2.2.4.1 mRNA的提取 | 第49页 |
| 2.2.4.2 mRNA的反转录 | 第49-50页 |
| 2.2.4.3 RT-qPCR分析埃博霉素基因簇的转录水平 | 第50-51页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第51-56页 |
| 2.3.1 ZE菌株发酵最佳接种量的测定 | 第51-52页 |
| 2.3.2 ZE菌株最佳发酵周期的测定 | 第52-53页 |
| 2.3.3 培养基添加油酸甲酯有效促进ZE菌合成埃博霉素 | 第53-56页 |
| 2.4 本章小结 | 第56-58页 |
| 第三章 埃博霉素转录调控因子的鉴定 | 第58-91页 |
| 3.1 实验材料 | 第58-62页 |
| 3.1.1 实验菌株及质粒 | 第58-59页 |
| 3.1.2 培养基 | 第59页 |
| 3.1.3 主要实验试剂 | 第59-61页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第61-62页 |
| 3.1.5 软件工具及数据库 | 第62页 |
| 3.2 实验方法 | 第62-74页 |
| 3.2.1 Esi基因敲除载体及过表达载体的构建 | 第62-66页 |
| 3.2.1.1 DNA片段的PCR扩增 | 第62-64页 |
| 3.2.1.2 质粒及DNA片段的酶切、连接和转化 | 第64-65页 |
| 3.2.1.3 大肠杆菌超级感受态细胞的制备 | 第65-66页 |
| 3.2.1.4 质粒的提取 | 第66页 |
| 3.2.1.5 Esi基因敲除载体的构建 | 第66页 |
| 3.2.1.6 Esi基因过表达载体的构建 | 第66页 |
| 3.2.2 Esi基因敲除菌株及过表达菌株的构建 | 第66-68页 |
| 3.2.2.1 黄色粘球菌的电转化 | 第66-67页 |
| 3.2.2.2 黄色粘球菌突变株的菌落PCR | 第67页 |
| 3.2.2.3 黄色粘球菌基因敲除突变株的筛选 | 第67-68页 |
| 3.2.2.4 黄色粘球菌的纯化 | 第68页 |
| 3.2.2.5 黄色粘球菌突变菌株的保存 | 第68页 |
| 3.2.3 黄色粘球菌生长曲线的测定 | 第68页 |
| 3.2.4 黄色粘球菌的发酵与埃博霉素的检测 | 第68页 |
| 3.2.5 埃博霉素基因簇转录水平的检测 | 第68-69页 |
| 3.2.6 Esi基因的生物信息学分析与功能预测 | 第69页 |
| 3.2.7 Esi蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第69-72页 |
| 3.2.7.1 Esi基因诱导表达载体的构建 | 第69页 |
| 3.2.7.2 Esi蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及检测 | 第69-71页 |
| 3.2.7.3 Esi蛋白的纯化 | 第71页 |
| 3.2.7.4 Esi蛋白浓度的测定 | 第71-72页 |
| 3.2.8 体外实验检测esi蛋白与埃博霉素启动子的相互作用 | 第72-74页 |
| 3.2.8.1 Band Shift Assay检测esi蛋白与埃博霉素启动子的结合 | 第72-73页 |
| 3.2.8.2 EMSA检测esi蛋白与预测最佳结合位点的结合 | 第73-74页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第74-89页 |
| 3.3.1 Esi在ZE菌中抑制埃博霉素的合成 | 第74-80页 |
| 3.3.1.1 Esi基因敲除载体和过表达载体的构建 | 第74-75页 |
| 3.3.1.2 Esi基因敲除菌株和过表达菌株的构建 | 第75-76页 |
| 3.3.1.3 Esi基因突变菌株生长能力分析 | 第76-77页 |
| 3.3.1.4 Esi基因突变菌株埃博霉素产生能力分析 | 第77-78页 |
| 3.3.1.5 Esi基因突变菌株中esi基因及埃博霉素基因簇转录水平检测 | 第78-80页 |
| 3.3.2 Esi基因的生物信息学分析与功能预测 | 第80-83页 |
| 3.3.3 Esi蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第83-86页 |
| 3.3.3.1 Esi诱导表达载体的构建 | 第83-84页 |
| 3.3.3.2 Esi蛋白的诱导表达及检测 | 第84页 |
| 3.3.3.3 Esi蛋白的纯化 | 第84-86页 |
| 3.3.3.4 Esi蛋白浓度的测定 | 第86页 |
| 3.3.4 体外验证esi蛋白与埃博霉素基因簇启动子的相互作用 | 第86-89页 |
| 3.3.4.1 Band Shift Assay检测esi蛋白与埃博霉素素基因簇启动子的结合 | 第86-88页 |
| 3.3.4.2 EMSA检测esi蛋白与预测最佳结合位点的结合 | 第88-89页 |
| 3.4 本章小结 | 第89-91页 |
| 第四章 埃博霉素基因簇启动子的遗传改造 | 第91-115页 |
| 4.1 实验材料 | 第92-93页 |
| 4.1.1 实验菌株及质粒 | 第92页 |
| 4.1.2 培养基 | 第92-93页 |
| 4.1.3 主要实验试剂 | 第93页 |
| 4.1.4 主要仪器设备 | 第93页 |
| 4.1.5 软件工具及数据库 | 第93页 |
| 4.2 实验方法 | 第93-96页 |
| 4.2.1 启动子活性报告载体的构建 | 第93-94页 |
| 4.2.2 启动子活性的检测与分析 | 第94页 |
| 4.2.3 启动子替换载体和启动子插入载体的构建 | 第94-96页 |
| 4.2.4 启动子替换和启动子插入突变株的构建 | 第96页 |
| 4.2.5 启动子改造突变株生长能力的分析 | 第96页 |
| 4.2.6 启动子改造突变株的发酵与埃博霉素产量检测 | 第96页 |
| 4.2.7 埃博霉素基因簇转录水平检测 | 第96页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第96-113页 |
| 4.3.1 内源性强启动子的筛选与分析 | 第96-99页 |
| 4.3.2 埃博霉素基因簇原始启动子的替换 | 第99-106页 |
| 4.3.2.1 启动子替换载体的构建 | 第99-100页 |
| 4.3.2.2 启动子替换突变株的构建 | 第100-102页 |
| 4.3.2.3 启动子替换突变株埃博霉素产生情况的分析 | 第102-104页 |
| 4.3.2.4 启动子替换导致埃博霉素产量下降的分子机制 | 第104-106页 |
| 4.3.3 埃博霉素基因簇内部启动子的插入 | 第106-113页 |
| 4.3.3.1 埃博霉素基因簇内各基因位置分析 | 第107-108页 |
| 4.3.3.2 启动子插入载体的构建 | 第108-109页 |
| 4.3.3.3 启动子插入突变株的构建 | 第109-110页 |
| 4.3.3.4 启动子插入突变株埃博霉素产生情况的分析 | 第110-113页 |
| 4.4 本章小结 | 第113-115页 |
| 第五章 埃博霉素异源表达宿主菌的遗传改造 | 第115-128页 |
| 5.1 实验材料 | 第115-116页 |
| 5.1.1 实验菌株及质粒 | 第115-116页 |
| 5.1.2 培养基 | 第116页 |
| 5.1.3 主要实验试剂 | 第116页 |
| 5.1.4 主要仪器设备 | 第116页 |
| 5.1.5 软件工具 | 第116页 |
| 5.2 实验方法 | 第116-118页 |
| 5.2.1 次级代谢基因簇的预测与分析 | 第116页 |
| 5.2.2 次级代谢基因簇失活载体的构建 | 第116-118页 |
| 5.2.3 次级代谢基因簇失活突变株的构建 | 第118页 |
| 5.2.4 次级代谢基因簇失活突变株生长曲线的测定 | 第118页 |
| 5.2.5 次级代谢基因簇失活突变株的发酵 | 第118页 |
| 5.2.6 次级代谢基因簇失活突变株中次级代谢产物的LC-MS检测 | 第118页 |
| 5.2.7 次级代谢基因簇失活突变株的埃博霉素产量的检测 | 第118页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第118-127页 |
| 5.3.1 DK1622中次级代谢基因簇的预测与分析 | 第118-120页 |
| 5.3.2 ZE9中次级代谢基因簇失活突变株的构建 | 第120-122页 |
| 5.3.3 次级代谢基因簇失活突变株生长能力分析及化合物检测 | 第122-126页 |
| 5.3.4 次级代谢基因簇失活突变株埃博霉素产生情况的分析 | 第126-127页 |
| 5.4 本章小结 | 第127-128页 |
| 总结与展望 | 第128-131页 |
| 附录 | 第131-133页 |
| 参考文献 | 第133-141页 |
| 致谢 | 第141-142页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第142-143页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第143页 |
