| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 目录 | 第9-12页 |
| 符号说明 | 第12-14页 |
| 前言 | 第14-17页 |
| 1 酵母双杂交筛选hPROKR2分子C末端相互作用蛋白 | 第17-69页 |
| 1.1 实验材料与试剂 | 第17-28页 |
| 1.1.1 主要实验仪器 | 第18-19页 |
| 1.1.2 主要实验试剂与耗材 | 第19-21页 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 | 第21-27页 |
| 1.1.4 实验用的细胞、质粒和菌种 | 第27-28页 |
| 1.2 实验方法 | 第28-54页 |
| 1.2.1 pGBKT7-hPROKR2-C末端表达载体的构建 | 第28-33页 |
| 1.2.2 酵母感受态的制备和转化 | 第33-34页 |
| 1.2.3 hPROKR2-C末端表达的蛋白毒性和自活性检测 | 第34页 |
| 1.2.4 pGBKT7-hPROKR2 C末端质粒成功转入酵母中的验证 | 第34-37页 |
| 1.2.5 酵母菌株的冻存 | 第37-38页 |
| 1.2.6 酵母双杂交及文库的筛选 | 第38-39页 |
| 1.2.7 相互作用阳性克隆的筛选 | 第39页 |
| 1.2.8 文库中与hPROKR2-C末端表达的蛋白相互作用片段质粒的提取 | 第39-40页 |
| 1.2.9 筛选到有意义人cDNA文库质粒的自活性验证 | 第40-42页 |
| 1.2.10 GST pull down验证hPROKR2 C末端与SNAPIN的相互作用 | 第42-52页 |
| 1.2.11 免疫共沉淀(CO-IP)验证实验 | 第52-53页 |
| 1.2.12 激光共聚焦显微镜检测hPROKR2与SNAPIN的共定位 | 第53-54页 |
| 1.3 实验结果 | 第54-65页 |
| 1.3.1 pGBKT7-hPROKR2-C末端表达载体的构建 | 第54-55页 |
| 1.3.2 酵母感受态的制备和转化 | 第55-56页 |
| 1.3.3 hPROKR2-C末端表达的蛋白毒性和自活性检测 | 第56-57页 |
| 1.3.4 pGBKT7-hPROKR2C末端质粒成功转入酵母中的验证 | 第57页 |
| 1.3.5 酵母双杂交及文库的筛选 | 第57-58页 |
| 1.3.6 相互作用阳性克隆的筛选 | 第58-60页 |
| 1.3.7 筛选到人cDNA文库质粒的自活性验证 | 第60-61页 |
| 1.3.8 体内体外对hPROKR2与SNAPIN相互作用的验证 | 第61-64页 |
| 1.3.9 免疫荧光验证hPROKR2与SNAPIN的相互作用 | 第64-65页 |
| 1.4 分析与讨论 | 第65-68页 |
| 1.5 结论 | 第68-69页 |
| 2 hPROKR2 C末端(333-384aa)与SNAPIN相互作用结构域的筛查 | 第69-112页 |
| 2.1 实验材料与试剂 | 第69-71页 |
| 2.1.1 主要实验仪器 | 第69页 |
| 2.1.2 主要实验试剂与耗材 | 第69-70页 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 | 第70页 |
| 2.1.4 实验用细胞和质粒 | 第70-71页 |
| 2.2 实验方法 | 第71-97页 |
| 2.2.1 hPROKR2同源分子hPROKRl与SNAPIN的相互作用 | 第71-75页 |
| 2.2.2 寻找SNAPIN不同功能区与PROKRs相互作用位点 | 第75-80页 |
| 2.2.3 hPROKR2 C末端与SNAPIN相互作用位点的寻找 | 第80-97页 |
| 2.3 实验结果 | 第97-107页 |
| 2.3.1 hPROKR2同源分子hPROKR1与SNAPIN的相互作用 | 第97-98页 |
| 2.3.2 寻找SNAPIN不同功能区与PROKRs相互作用位点 | 第98-101页 |
| 2.3.3 hPROKR2 C末端与SNAPIN相互作用位点的寻找 | 第101-107页 |
| 2.4 分析与讨论 | 第107-111页 |
| 2.5 结论 | 第111-112页 |
| 3 SNAPIN协助hPROKR2分子的再循环 | 第112-141页 |
| 3.1 实验材料与试剂 | 第112-116页 |
| 3.1.1 主要实验仪器 | 第113页 |
| 3.1.2 主要实验试剂与耗材 | 第113-114页 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 | 第114-116页 |
| 3.1.4 实验用细胞与质粒 | 第116页 |
| 3.2 实验方法 | 第116-129页 |
| 3.2.1 PK2的制备及功效评价 | 第116-118页 |
| 3.2.2 RNAi质粒的构建及验证 | 第118-123页 |
| 3.2.3 6A-hPROKR2-GFP(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)质粒的构建. | 第123-125页 |
| 3.2.4 hPROKR2(wt)-GFP和6A-hPROKR2-GFP的测活 | 第125-126页 |
| 3.2.5 激光共聚焦显微镜检测hPROKR2分子野生型(SNAPIN沉默与否)与6A-hPROKR2分子在PK2刺激内吞与上膜的差异 | 第126-127页 |
| 3.2.6 hPROKR2蛋白的降解 | 第127-128页 |
| 3.2.7 统计学方法 | 第128-129页 |
| 3.3 实验结果 | 第129-137页 |
| 3.3.1 PK2的制备 | 第129-130页 |
| 3.3.2 RNAi质粒的构建及验证 | 第130-131页 |
| 3.3.3 6A-hPROKR2-GFP质粒的构建 | 第131-132页 |
| 3.3.4 测活 | 第132页 |
| 3.3.5 免疫荧光结果统计 | 第132-137页 |
| 3.3.6 hPROKR2蛋白的降解 | 第137页 |
| 3.4 分析与讨论 | 第137-140页 |
| 3.5 结论 | 第140-141页 |
| 结论 | 第141-142页 |
| 参考文献 | 第142-149页 |
| 综述 | 第149-165页 |
| 参考文献 | 第158-165页 |
| 攻读学位期间主要成果 | 第165-166页 |
| 致谢 | 第166-167页 |
| 附录 | 第167-173页 |
