| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略语 | 第8-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-20页 |
| 1 NAT相关概述 | 第14-16页 |
| 1.1 NAT作用机制 | 第14页 |
| 1.2 NAT的催化活性 | 第14页 |
| 1.3 NAT功能 | 第14-16页 |
| 1.3.1 NAT与色素沉积及生理节律调控 | 第15页 |
| 1.3.2 NAT与昆虫几丁质合成 | 第15页 |
| 1.3.3 NAT与抗药植物的开发 | 第15页 |
| 1.3.4 NAT与癌症相关研究 | 第15-16页 |
| 2 BmNAT的相关研究进展 | 第16-19页 |
| 2.1 BmNAT与家蚕色素沉积 | 第17-18页 |
| 2.2 BmNAT与生理节律 | 第18-19页 |
| 3 BmNAT研究意义 | 第19-20页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第20-22页 |
| 1 实验目的、意义 | 第20页 |
| 2 研究内容 | 第20-21页 |
| 3 实验流程图 | 第21-22页 |
| 第三章 生物信息学分析 | 第22-29页 |
| 1 序列与工具 | 第22页 |
| 1.1 序列 | 第22页 |
| 1.2 工具 | 第22页 |
| 2 方法 | 第22-23页 |
| 3 结果 | 第23-27页 |
| 3.1 BmNAT基因的序列分析 | 第23页 |
| 3.2 BmNAT蛋白的疏水性分析 | 第23-24页 |
| 3.3 BmNAT蛋白的跨膜区预测 | 第24-25页 |
| 3.4 BmNAT蛋白的信号肽分析 | 第25页 |
| 3.5 BmNAT蛋白的二级结构预测 | 第25页 |
| 3.6 BmNAT蛋白的三级结构 | 第25-26页 |
| 3.7 BmNAT蛋白的序列同源性分析和基于序列同源性的系统发生树 | 第26-27页 |
| 4 讨论 | 第27-29页 |
| 第四章 BmNAT基因的原核表达与抗体制备 | 第29-50页 |
| 1 材料与试剂 | 第29-33页 |
| 1.1 材料 | 第29页 |
| 1.2 试剂 | 第29-30页 |
| 1.3 主要试剂的配置 | 第30-33页 |
| 2 方法 | 第33-44页 |
| 2.1 家蚕组织总RNA的提取和cDNA的合成 | 第33页 |
| 2.2 cDNA第一链的合成 | 第33-34页 |
| 2.3 重组质粒pET28a-BmNAT的构建 | 第34-39页 |
| 2.3.1 BmNAT基因的PCR扩增 | 第34-35页 |
| 2.3.2 pET-28a(+)空载质粒的提取 | 第35页 |
| 2.3.3 PCR扩增产物（BmNAT）和pET-28a(+)空载质粒的双酶切 | 第35-36页 |
| 2.3.4 pET-28a(+)载体双酶切产物的 5’端去磷酸化 | 第36页 |
| 2.3.5 连接反应 | 第36-37页 |
| 2.3.6 利用CaCl2法制备E.coli TG1和E.coli BL21（DE3）感受态细胞 | 第37页 |
| 2.3.7 连接产物的转化 | 第37-38页 |
| 2.3.8 重组质粒提取 | 第38页 |
| 2.3.9 菌液PCR及重组质粒的双酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.10 重组质粒的测序鉴定 | 第39页 |
| 2.3.11 重组质粒转化BL21(DE3)与鉴定 | 第39页 |
| 2.4 BmNAT蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 | 第39-42页 |
| 2.4.1 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 | 第39-40页 |
| 2.4.2 SDS-PAGE电泳分析 | 第40-41页 |
| 2.4.3 融合蛋白包涵体的洗涤和溶解 | 第41页 |
| 2.4.4 蛋白割胶回收 | 第41-42页 |
| 2.4.5 纯化抗原的检测 | 第42页 |
| 2.5 抗体的制备 | 第42-43页 |
| 2.5.1 抗原的制备 | 第42页 |
| 2.5.2 免疫新西兰大白兔 | 第42-43页 |
| 2.5.3 多克隆抗血清的制备 | 第43页 |
| 2.6 抗体特异性的Western blotting鉴定 | 第43页 |
| 2.7 间接ELISA法测定抗体效价 | 第43-44页 |
| 3 结果 | 第44-48页 |
| 3.1 PCR扩增目的片段及重组质粒的双酶切鉴定 | 第44-45页 |
| 3.2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 | 第45-46页 |
| 3.3 融合蛋白的Western blotting检测 | 第46-47页 |
| 3.4 兔多抗血清的Western blotting检测 | 第47-48页 |
| 3.5 多抗的效价检测 | 第48页 |
| 4 讨论 | 第48-50页 |
| 第五章 家蚕BmNAT基因的转录及BmNAT蛋白的表达分析 | 第50-57页 |
| 1 材料与试剂 | 第50页 |
| 1.1 材料 | 第50页 |
| 1.2 试剂 | 第50页 |
| 2 方法 | 第50-54页 |
| 2.1 家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织总RNA的提取 | 第50-51页 |
| 2.2 家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织总蛋白提取 | 第51页 |
| 2.3 BmNAT在家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织中的表达分析（mRNA水平） | 第51-53页 |
| 2.3.1 cDNA第一链的合成 | 第51-52页 |
| 2.3.2 qRT-PCR分析BmNAT基因在家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织的转录水平分析 | 第52-53页 |
| 2.4 BmNAT蛋白在家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织的表达分析（蛋白水平） | 第53-54页 |
| 3 结果 | 第54-55页 |
| 3.1 五龄幼虫各组织和家蚕各发育时期中BmNAT基因转录水平分析 | 第54页 |
| 3.2 五龄幼虫各组织和家蚕各发育时期中BmNAT蛋白表达水平分析 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-57页 |
| 第六章 家蚕BmNAT蛋白亚细胞定位研究 | 第57-62页 |
| 1 材料与试剂 | 第57-58页 |
| 1.1 材料 | 第57页 |
| 1.2 试剂 | 第57页 |
| 1.3 试剂配制 | 第57-58页 |
| 2 方法 | 第58-59页 |
| 2.1 细胞冻存 | 第58页 |
| 2.2 细胞复苏 | 第58页 |
| 2.3 家蚕细胞BmN贴壁培养 | 第58-59页 |
| 2.4 亚细胞定位 | 第59页 |
| 3 结果 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-62页 |
| 第七章 BmNAT在细胞中的过表达研究 | 第62-70页 |
| 1 材料与试剂 | 第62页 |
| 1.1 材料 | 第62页 |
| 1.2 试剂 | 第62页 |
| 1.3 主要试剂的配置 | 第62页 |
| 2 方法 | 第62-65页 |
| 2.1 真核重组表达质粒pIEX1BmNAT的构建 | 第62-63页 |
| 2.2 重组质粒的转染 | 第63-64页 |
| 2.3 转染蛋白表达量最高的时间的确定 | 第64页 |
| 2.4 流式细胞仪检测 | 第64-65页 |
| 3 结果 | 第65-69页 |
| 3.1 真核重组表达载体pIEx1BmNAT的PCR扩增及双酶切鉴定 | 第65-66页 |
| 3.2 转染时间的优化 | 第66页 |
| 3.3 BmNAT基因过表达的鉴定 | 第66-67页 |
| 3.4 流式细胞检测结果 | 第67-69页 |
| 4 讨论 | 第69-70页 |
| 第八章 BmNAT蛋白的免疫沉淀和乙酰化鉴定 | 第70-78页 |
| 1 材料与试剂 | 第70页 |
| 1.1 材料 | 第70页 |
| 1.2 试剂及仪器 | 第70页 |
| 2 方法 | 第70-72页 |
| 2.1 抗体纯化 | 第70-71页 |
| 2.2 定点突变 | 第71-72页 |
| 2.3 家蚕组织/细胞中BmNAT蛋白的免疫沉淀 | 第72页 |
| 3 结果 | 第72-76页 |
| 3.1 BmNAT蛋白的乙酰化肽段质谱 | 第72-73页 |
| 3.2 兔多克隆抗体的纯化 | 第73页 |
| 3.3 BmNAT蛋白的免疫沉淀和乙酰化鉴定 | 第73-74页 |
| 3.4 定点突变质粒的构建 | 第74-75页 |
| 3.5 BmNAT蛋白突变体的乙酰化鉴定 | 第75-76页 |
| 4 讨论 | 第76-78页 |
| 结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
