| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 第1章 绪论 | 第14-27页 |
| 1.1 糖化酶研究进展 | 第14-21页 |
| 1.1.1 糖化酶的来源 | 第14页 |
| 1.1.2 糖化酶组分多型性 | 第14-15页 |
| 1.1.3 糖化酶的结构与功能原理 | 第15-16页 |
| 1.1.4 糖化酶的酶学性质 | 第16-17页 |
| 1.1.4.1 最适温度和热稳定性 | 第16-17页 |
| 1.1.4.2 最适p H和p H耐受性 | 第17页 |
| 1.1.4.3 金属离子对糖化酶酶活的影响 | 第17页 |
| 1.1.4.4 糖化酶降解生淀粉的性质分析 | 第17页 |
| 1.1.5 测定糖化酶酶活的方法 | 第17-18页 |
| 1.1.5.1 国标法 | 第17-18页 |
| 1.1.5.2 滴定法 | 第18页 |
| 1.1.5.3 比色法 | 第18页 |
| 1.1.6 糖化酶的应用 | 第18-20页 |
| 1.1.6.1 糖化酶在酿制白酒中的应用 | 第18-19页 |
| 1.1.6.2 糖化酶在酿制啤酒中的应用 | 第19页 |
| 1.1.6.3 糖化酶在食醋酿造工艺的应用 | 第19-20页 |
| 1.1.6.4 糖化酶在冰冻食品生产加工中的应用 | 第20页 |
| 1.1.6.5 糖化酶在中药材制作中的应用 | 第20页 |
| 1.1.7 糖化酶的研究前景 | 第20-21页 |
| 1.2 α-葡萄糖苷酶的研究概况 | 第21-22页 |
| 1.2.1 α-葡萄糖苷酶的作用原理 | 第21页 |
| 1.2.2 α-葡萄糖苷酶与糖化酶之间的联系 | 第21-22页 |
| 1.2.3 α-葡萄糖苷酶基因相关功能研究 | 第22页 |
| 1.3 丝状真菌基因改造方法 | 第22-25页 |
| 1.3.1 农杆菌转染法 | 第22-23页 |
| 1.3.2 RNA干扰技术的应用 | 第23页 |
| 1.3.3 Split-Marker技术 | 第23-25页 |
| 1.4 研究目的和主要内容 | 第25-27页 |
| 1.4.1 研究目的及意义 | 第25-26页 |
| 1.4.2 研究主要内容 | 第26-27页 |
| 第2章 材料和方法 | 第27-53页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-32页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第27-30页 |
| 2.1.1.1 实验培养基 | 第27-28页 |
| 2.1.1.2 实验试剂 | 第28-30页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第30-31页 |
| 2.1.3 寡聚核苷酸引物 | 第31-32页 |
| 2.1.4 实验试剂 | 第32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-44页 |
| 2.2.1 基础实验方法 | 第32-39页 |
| 2.2.1.1 菌种的培养及保种 | 第32-33页 |
| 2.2.1.2 真菌基因组DNA的提取（OMEGA试剂盒） | 第33-34页 |
| 2.2.1.3 质粒的小量提取（Genstar试剂盒） | 第34-35页 |
| 2.2.1.4 DNA的切胶回收（Takara试剂盒） | 第35-36页 |
| 2.2.1.5 PCR产物的纯化步骤（OMEGA试剂盒） | 第36页 |
| 2.2.1.6 感受态细胞的制备（Takara试剂盒） | 第36-37页 |
| 2.2.1.7 目的片段连接至p MD 19-T-Vector (Simple) | 第37-38页 |
| 2.2.1.8 目的片段DNA转化感受态细胞 | 第38-39页 |
| 2.2.1.9 大肠杆菌转化子菌落PCR验证 | 第39页 |
| 2.2.2 敲除表达盒的构建 | 第39-43页 |
| 2.2.2.1 黑曲霉HE01中α-葡萄糖苷酶基因上游α-glu E1和下游α-glu E2的扩增 | 第40-41页 |
| 2.2.2.2 抗性基因Nours. Resistan的扩增 | 第41页 |
| 2.2.2.3 敲除表达盒的构建 | 第41-43页 |
| 2.2.3 黑曲霉HE01的原生质体转化方法 | 第43-44页 |
| 2.3 黑曲霉突变体的筛选及验证 | 第44-46页 |
| 2.4 黑曲霉突变株的表型分析 | 第46-53页 |
| 2.4.1 菌丝生长情况测定 | 第46-47页 |
| 2.4.1.1 平板上的菌丝生长形态 | 第46页 |
| 2.4.1.2 菌株生物量测定 | 第46-47页 |
| 2.4.2 酶活的测定 | 第47-49页 |
| 2.4.2.1 糖化酶酶活的测定 | 第47-48页 |
| 2.4.2.2 α-葡萄糖苷酶酶活的测定 | 第48-49页 |
| 2.4.3 荧光定量PCR | 第49-53页 |
| 2.4.3.1 出发株和突变株的总RNA提取 | 第49-50页 |
| 2.4.3.2 反转录PCR | 第50-51页 |
| 2.4.3.3 荧光定量PCR | 第51-53页 |
| 第3章 结果与分析 | 第53-70页 |
| 3.1 敲除表达盒的构建 | 第53-57页 |
| 3.1.1 黑曲霉HE01基因组DNA的提取 | 第53页 |
| 3.1.2 黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因两端同源序列的扩增 | 第53-54页 |
| 3.1.3 选择性标记基因的扩增与分析 | 第54-55页 |
| 3.1.4 敲除表达盒的构建 | 第55-56页 |
| 3.1.5 PCR验证大肠杆菌阳性转化子 | 第56-57页 |
| 3.2 黑曲霉HE01的原生质体转化和转化子鉴定 | 第57-59页 |
| 3.2.1 线性表达盒转入黑曲霉HE01 | 第57-58页 |
| 3.2.2 突变黑曲霉HE01的基因水平鉴定 | 第58-59页 |
| 3.3 黑曲霉出发株与突变株的表型分析 | 第59-70页 |
| 3.3.1 出发株与突变株的菌丝生长情况 | 第59-62页 |
| 3.3.1.1 平板上的菌丝生长形态 | 第59-61页 |
| 3.3.1.2 生物量的测定与生长曲线的制作 | 第61-62页 |
| 3.3.2 黑曲霉HE01出发株与突变株的酶活测定结果分析 | 第62-65页 |
| 3.3.2.1 出发株和突变株的糖化酶酶活 | 第63-64页 |
| 3.3.2.2 出发株和突变株的 α-葡萄糖苷酶酶活 | 第64-65页 |
| 3.3.3 实时荧光定量PCR | 第65-70页 |
| 第4章 讨论 | 第70-76页 |
| 4.1 融合基因的获得 | 第70-71页 |
| 4.2 黑曲霉原生质体转化技术 | 第71-72页 |
| 4.3 抗性标记基因替换靶基因 | 第72-73页 |
| 4.4 黑曲霉突变株的糖化酶和α-葡萄糖苷酶酶活 | 第73-74页 |
| 4.5 荧光定量PCR检测糖化酶基因水平表达量 | 第74-75页 |
| 4.6 创新点 | 第75-76页 |
| 结论 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-88页 |
| 附录 | 第88-92页 |
| 致谢 | 第92-94页 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 | 第94页 |
