| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第11-15页 |
| 1.1 内皮抑素与肿瘤 | 第11-13页 |
| 1.1.1 内皮抑素概况 | 第11页 |
| 1.1.2 内皮抑素机理研究 | 第11-12页 |
| 1.1.3 内皮抑素临床研究 | 第12-13页 |
| 1.2 人血清白蛋白融合 | 第13-15页 |
| 1.2.1 人血清白蛋白概况 | 第13页 |
| 1.2.2 HSA融合技术优点 | 第13页 |
| 1.2.3 与HSA融合延长蛋白质药物半衰期的研究 | 第13-14页 |
| 1.2.4 展望 | 第14-15页 |
| 第二章 长效内皮抑素在毕赤酵母GS115中的表达 | 第15-31页 |
| 2.1 材料 | 第15-17页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第15页 |
| 2.1.2 主要工具酶和试剂盒 | 第15-16页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第16页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第16页 |
| 2.1.5 培养基 | 第16-17页 |
| 2.2 方法 | 第17-25页 |
| 2.2.1 人血清白蛋白HSA的密码子优化,并插入穿梭质粒pPICZaA上 | 第17-18页 |
| 2.2.2 质粒pBV220-ES的提取 | 第18-19页 |
| 2.2.3 PCR扩增ES基因 | 第19-20页 |
| 2.2.4 PCR扩增的ES基因的纯化 | 第20页 |
| 2.2.5 重组质粒pPICZαA-HSA-ES的构建 | 第20页 |
| 2.2.6 DH5α感受态细胞的制备及转化 | 第20-21页 |
| 2.2.7 表达载体pPICZαA-HSA-ES的鉴定 | 第21-22页 |
| 2.2.8 线性化pPICZαA-HSA-ES片段的制备 | 第22页 |
| 2.2.9 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备和转化 | 第22-23页 |
| 2.2.10 阳性转化子的鉴定 | 第23-24页 |
| 2.2.11 阳性转化子的小量表达和鉴定 | 第24-25页 |
| 2.2.12 比较融合蛋白HSA-ES不同时间表达量 | 第25页 |
| 2.2.13 用免疫比浊法测定表达蛋白浓度 | 第25页 |
| 2.3 结果 | 第25-30页 |
| 2.3.1 重组质粒pPICZαA-HSA-ES的构建和鉴定 | 第25-27页 |
| 2.3.2 转化酵母的鉴定 | 第27页 |
| 2.3.3 表达产物的鉴定 | 第27-29页 |
| 2.3.3.1 表达蛋白的SDS-PAGE鉴定 | 第27-28页 |
| 2.3.3.2 表达蛋白的Western Blot鉴定 | 第28-29页 |
| 2.3.4 比较融合蛋白HSA-ES不同时间表达量a | 第29页 |
| 2.3.5 用免疫比浊法测定表达蛋白浓度 | 第29-30页 |
| 2.4 讨论 | 第30-31页 |
| 第三章 肝素酶在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测 | 第31-46页 |
| 3.1 研究背景 | 第31-32页 |
| 3.2 材料 | 第32-34页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第32页 |
| 3.2.2 培养基 | 第32-33页 |
| 3.2.3 试剂 | 第33页 |
| 3.2.3.1 主要工具酶和试剂盒 | 第33页 |
| 3.2.3.2 其它试剂 | 第33页 |
| 3.2.4 仪器设备 | 第33-34页 |
| 3.3 实验方法 | 第34-41页 |
| 3.3.1 肝素黄杆菌基因组DNA的提取 | 第34-35页 |
| 3.3.2 pET-28a质粒的提取 | 第35页 |
| 3.3.3 肝素黄杆菌肝素酶Hep Ⅰ基因的扩增 | 第35-36页 |
| 3.3.4 PCR扩增的HepⅠ基因的纯化 | 第36页 |
| 3.3.5 用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切Hep Ⅰ基因和pET-28a质粒 | 第36页 |
| 3.3.6 DH5a感受态细胞的制备及转化 | 第36-37页 |
| 3.3.7 表达载体pET-28a-Hep Ⅰ的鉴定 | 第37-38页 |
| 3.3.8 阳性转化子的鉴定 | 第38页 |
| 3.3.9 阳性转化子的表达和鉴定 | 第38-39页 |
| 3.3.10 HepⅠ的表达和纯化 | 第39-40页 |
| 3.3.10.1 肝素酶Ⅰ的表达 | 第39页 |
| 3.3.10.2 肝素酶Ⅰ的纯化 | 第39-40页 |
| 3.3.11 肝素酶Ⅰ活性的测定 | 第40-41页 |
| 3.3.11.1 肝素酶Ⅰ标准曲线的建立 | 第40页 |
| 3.3.11.2 肝素酶Ⅰ活性测定方法 | 第40-41页 |
| 3.4 结果 | 第41-45页 |
| 3.4.1 表达载体pET-28a-Hep Ⅰ的PCR鉴定 | 第41-42页 |
| 3.4.2 重组质粒BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定 | 第42-43页 |
| 3.4.3 表达蛋白的SDS-PAGE鉴定 | 第43页 |
| 3.4.4 HepⅠ的纯化 | 第43-44页 |
| 3.4.5 肝素酶Ⅰ的活性测定 | 第44-45页 |
| 3.5 结论 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-48页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第48-49页 |
| 致谢 | 第49-51页 |
