| 致谢 | 第6-7页 |
| 摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略表 | 第13-20页 |
| 第一章 绪论 | 第20-45页 |
| 1.1 引言 | 第20-21页 |
| 1.2 内耳毛细胞的损伤与再生 | 第21-22页 |
| 1.3 基因调控毛细胞再生的研究进展 | 第22页 |
| 1.4 干细胞治疗神经性耳聋的研究进展 | 第22-29页 |
| 1.4.1 胚胎干细胞分化为毛细胞的研究进展 | 第23-25页 |
| 1.4.2 多能型干细胞(iPSCs)应用于毛细胞再生的前景 | 第25-26页 |
| 1.4.3 间充质干细胞分化为毛细胞的研究进展 | 第26-27页 |
| 1.4.4 内耳干细胞分化为毛细胞的研究进展 | 第27-28页 |
| 1.4.5 神经干细胞分化为毛细胞的研究进展 | 第28-29页 |
| 1.5 毛细胞体外功能再生的研究 | 第29-30页 |
| 1.5.1 再生毛细胞的前体细胞来源的研究 | 第29页 |
| 1.5.2 支持细胞与再生毛细胞联系的研究 | 第29页 |
| 1.5.3 再生毛细胞结构和功能的研究 | 第29-30页 |
| 1.6 毛细胞再生相关分子机理的研究 | 第30-38页 |
| 1.6.1 转录因子 | 第31-33页 |
| 1.6.2 生长因子 | 第33-34页 |
| 1.6.3 Notch信号通路 | 第34-38页 |
| 1.6.3.1 典型的Notch信号通路 | 第34-35页 |
| 1.6.3.2 侧向抑制作用：毛细胞vs支持细胞 | 第35-38页 |
| 参考文献 | 第38-45页 |
| 第二章 人胚胎干细胞体外诱导分化为内耳祖细胞 | 第45-67页 |
| 2.1 前言 | 第45-46页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第46-50页 |
| 2.2.1 实验细胞系及实验动物 | 第46-47页 |
| 2.2.2 主要实验试剂 | 第47-48页 |
| 2.2.3 常用仪器 | 第48-49页 |
| 2.2.4 常用试剂配置 | 第49-50页 |
| 2.3 实验方法 | 第50-56页 |
| 2.3.1 MEF细胞的原代分离及冻存 | 第50页 |
| 2.3.2 MEF细胞的复苏及饲养层细胞的制备 | 第50-51页 |
| 2.3.3 胚胎干细胞的培养及传代 | 第51页 |
| 2.3.4 内耳祖细胞的诱导分化 | 第51-53页 |
| 2.3.4.1 拟胚体组合因子诱导法 | 第51-52页 |
| 2.3.4.2 单层贴壁诱导法 | 第52-53页 |
| 2.3.5 内耳祖细胞的鉴定 | 第53-56页 |
| 2.3.5.1 内耳祖细胞标志基因检测 | 第53-55页 |
| 2.3.5.2 内耳祖细胞特异性蛋白检测 | 第55-56页 |
| 2.3.6 统计学处理 | 第56页 |
| 2.4 实验结果 | 第56-63页 |
| 2.4.1 MEF细胞的培养与饲养层细胞的制备 | 第56-57页 |
| 2.4.2 hESCs的培养与传代 | 第57-58页 |
| 2.4.3 拟胚体组合因子诱导法的实验结果 | 第58-60页 |
| 2.4.3.1 拟胚体的形成 | 第58页 |
| 2.4.3.2 拟胚体诱导9天后检测外胚层基因的表达 | 第58-59页 |
| 2.4.3.3 拟胚体贴壁培养 | 第59-60页 |
| 2.4.4 单层贴壁诱导法的实验结果 | 第60-63页 |
| 2.4.4.1 hESCs单层贴壁诱导分化的形态变化 | 第60-61页 |
| 2.4.4.2 内耳祖细胞标志基因检测 | 第61-62页 |
| 2.4.4.3 内耳祖细胞特异蛋白免疫荧光检测 | 第62-63页 |
| 2.5 讨论 | 第63-64页 |
| 2.6 本章小结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-67页 |
| 第三章 内耳上皮祖细胞体外诱导分化为毛细胞 | 第67-99页 |
| 3.1 前言 | 第67-69页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第69-72页 |
| 3.2.1 实验细胞系及实验动物 | 第69页 |
| 3.2.2 主要实验试剂 | 第69-70页 |
| 3.2.3 常用仪器 | 第70-71页 |
| 3.2.4 常用试剂配置 | 第71-72页 |
| 3.3 实验方法 | 第72-78页 |
| 3.3.1 内耳祖细胞的诱导与培养 | 第72页 |
| 3.3.2 鸡胚椭圆囊基质细胞的分离、培养与处理 | 第72-73页 |
| 3.3.3 内耳祖细胞向毛细胞的诱导分化 | 第73-75页 |
| 3.3.3.1 细胞爬片的预处理 | 第74页 |
| 3.3.3.2 内耳祖细胞向毛细胞诱导分化的步骤 | 第74-75页 |
| 3.3.4 内耳毛细胞阶段标志基因的检测 | 第75-76页 |
| 3.3.5 内耳毛细胞标志蛋白的检测 | 第76-77页 |
| 3.3.6 扫描电子显微镜的检测 | 第77页 |
| 3.3.7 毛细胞电生理的检测 | 第77-78页 |
| 3.4 实验结果 | 第78-92页 |
| 3.4.1 内耳祖细胞体外诱导分化的形态变化 | 第78-80页 |
| 3.4.2 毛细胞的基因检测 | 第80-81页 |
| 3.4.3 毛细胞和支持细胞标志蛋白的检测 | 第81-85页 |
| 3.4.4 毛细胞静纤毛(stereocilia)和动纤毛(kinocilia)的蛋白检测 | 第85-87页 |
| 3.4.5 毛细胞的电镜检测 | 第87-89页 |
| 3.4.6 毛细胞的电生理功能检测 | 第89-92页 |
| 3.5 讨论 | 第92-95页 |
| 3.6 本章小结 | 第95-97页 |
| 参考文献 | 第97-99页 |
| 第四章 RNA干扰Notch信号调控毛细胞的体外分化 | 第99-141页 |
| 4.1 前言 | 第99-100页 |
| 4.2 实验材料 | 第100-103页 |
| 4.2.1 实验细胞及质粒 | 第100-101页 |
| 4.2.2 主要实验试剂 | 第101-102页 |
| 4.2.3 常用仪器 | 第102页 |
| 4.2.4 常用试剂配置 | 第102-103页 |
| 4.3 试验方法 | 第103-119页 |
| 4.3.1 不同分化阶段内耳祖细胞和毛细胞样细胞的准备 | 第103页 |
| 4.3.2 RT-PCR法检测hESCs向毛细胞诱导分化过程中的Notch信号表达时序 | 第103-104页 |
| 4.3.3 siRNA的设计合成 | 第104-108页 |
| 4.3.4 提取质粒 | 第108页 |
| 4.3.5 干扰质粒瞬时转染靶细胞检测干扰效率 | 第108-110页 |
| 4.3.5.1 干扰质粒瞬时转染靶细胞 | 第109页 |
| 4.3.5.2 Real-Time PCR检测干扰效率 | 第109-110页 |
| 4.3.6 shRNA干扰质粒的慢病毒包装 | 第110-114页 |
| 4.3.6.1 慢病毒包装的具体操作步骤 | 第111-112页 |
| 4.3.6.2 病毒上清的收集与浓缩 | 第112页 |
| 4.3.6.3 病毒滴度的测定 | 第112-114页 |
| 4.3.7 慢病毒感染靶细胞 | 第114页 |
| 4.3.8 稳定感染细胞的鉴定 | 第114-116页 |
| 4.3.8.1 SDS-PAGE电泳 | 第114-115页 |
| 4.3.8.2 转膜 | 第115页 |
| 4.3.8.3 Western-blot | 第115-116页 |
| 4.3.9 感染后细胞的流式分选及GFP阳性细胞的后续培养 | 第116-117页 |
| 4.3.10 下调Notch信号配体的表达对毛细胞体外诱导分化的影响 | 第117-119页 |
| 4.3.10.1 下调Jag-1基因的表达对毛细胞体外诱导分化的影响 | 第117-118页 |
| 4.3.10.2 下调Jag-2基因的表达对毛细胞体外诱导分化的影响 | 第118页 |
| 4.3.10.3 下调Dll-1基因的表达对毛细胞体外诱导分化的影响 | 第118-119页 |
| 4.3.10.4 同时下调Jag-2和Dll-1基因的表达对毛细胞体外诱导分化的影响 | 第119页 |
| 4.3.11 统计学处理 | 第119页 |
| 4.4 实验结果 | 第119-136页 |
| 4.4.1 毛细胞体外诱导分化过程中Notch信号的表达时序 | 第119-120页 |
| 4.4.2 shRNA干扰质粒对目的基因mRNA的影响 | 第120-122页 |
| 4.4.3 慢病毒滴度的检测结果 | 第122-123页 |
| 4.4.4 慢病毒感染靶细胞 | 第123-124页 |
| 4.4.5 稳定感染细胞的鉴定 | 第124-126页 |
| 4.4.6 稳定感染Jag-1-shRNA2的祖细胞的流式分选 | 第126-127页 |
| 4.4.7 内耳祖细胞标志基因检测 | 第127-128页 |
| 4.4.8 内耳祖细胞特异蛋白的免疫荧光检测 | 第128-129页 |
| 4.4.9 毛细胞及支持细胞标志基因检测 | 第129-130页 |
| 4.4.10 毛细胞标志蛋白的检测 | 第130-134页 |
| 4.4.11 毛细胞的电镜检测 | 第134-136页 |
| 4.5 讨论 | 第136-138页 |
| 4.6 本章小结 | 第138-139页 |
| 参考文献 | 第139-141页 |
| 第五章 结论与展望 | 第141-144页 |
| 附录 | 第144页 |
