| 中文摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略词 | 第7-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-17页 |
| 1 副溶血弧菌 | 第12页 |
| 2 蛋白质磷酸化修饰及细菌的Ser/Thr蛋白激酶的相关研究 | 第12-13页 |
| 2.1 蛋白质磷酸化修饰的研究现状 | 第12-13页 |
| 2.2 细菌的Ser/Thr蛋白激酶的研究 | 第13页 |
| 3 副溶血弧菌的毒力因子 | 第13-16页 |
| 3.1 粘附素 | 第14页 |
| 3.2 T3SS | 第14-15页 |
| 3.3 T6SS | 第15-16页 |
| 4 研究目的和意义 | 第16-17页 |
| 第二章 副溶血弧菌VP0057敲除菌株的构建 | 第17-32页 |
| 1 前言 | 第17页 |
| 2 实验材料 | 第17-19页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第17页 |
| 2.2 主要试剂（盒） | 第17-18页 |
| 2.3 主要仪器 | 第18页 |
| 2.4 主要溶液配制 | 第18-19页 |
| 3 实验方法 | 第19-25页 |
| 3.1 引物设计 | 第19页 |
| 3.2 VP0057同源臂扩增及融合 | 第19-21页 |
| 3.2.1 VP0057同源臂的扩增 | 第19-21页 |
| 3.2.2 VP0057同源臂的融合 | 第21页 |
| 3.3 重组质粒的构建 | 第21-22页 |
| 3.3.1 融合片段、质粒双酶切 | 第21-22页 |
| 3.3.2 酶切后的融合片段与质粒连接 | 第22页 |
| 3.4 大肠杆菌S17-1（λpir）感受态细胞的制备 | 第22-23页 |
| 3.5 连接产物转化至大肠杆菌S17-1（λpir）感受态细胞 | 第23页 |
| 3.6 重组质粒的鉴定 | 第23-24页 |
| 3.6.1 重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第23页 |
| 3.6.2 重组质粒的测序鉴定 | 第23-24页 |
| 3.7 第一轮重组 | 第24页 |
| 3.8 第二轮重组 | 第24-25页 |
| 4 结果 | 第25-30页 |
| 4.1 VP0057结构和功能预测 | 第25-27页 |
| 4.2 VP0057结构域同源臂扩增和融合 | 第27页 |
| 4.3 重组质粒的构建及鉴定 | 第27-28页 |
| 4.4 重组与敲除菌鉴定 | 第28-30页 |
| 5 讨论 | 第30-32页 |
| 第三章 VP0057对副溶血弧菌毒力的调控作用 | 第32-44页 |
| 1 前言 | 第32页 |
| 2 材料 | 第32-33页 |
| 2.1 主要试剂（盒） | 第32-33页 |
| 2.2 实验仪器 | 第33页 |
| 3 实验方法 | 第33-38页 |
| 3.1 VP和△VP0057在不同培养基中生长情况的差异比较 | 第33页 |
| 3.2 VP0057介导副溶血弧菌对HeLa细胞的粘附能力 | 第33-36页 |
| 3.2.1 RT-PCR验证MAM-7（VP1611）的转录表达情况 | 第33-35页 |
| 3.2.1.1 RT-PCR引物设计 | 第33-34页 |
| 3.2.1.2 总RNA的反转录 | 第34页 |
| 3.2.1.3 RT-PCR检测粘附因子VP1611转录情况 | 第34-35页 |
| 3.2.2 VP和△VP0057粘附HeLa细胞的差异比较 | 第35-36页 |
| 3.2.2.1 细胞铺板 | 第35页 |
| 3.2.2.2 VP和△VP0057粘附HeLa细胞后平板计数 | 第35-36页 |
| 3.3 VP和△VP0057的生物被膜产量的差异比较 | 第36-37页 |
| 3.4 VP和△VP0057中T3SS1和T3SS2效应蛋白表达的差异分析 | 第37-38页 |
| 3.4.1 RT-PCR检测VP和△VP0057的VP1680和VPA1346的转录 | 第37-38页 |
| 3.4.1.1 RT-PCR引物设计 | 第37页 |
| 3.4.1.2 RT-PCR检测VP1680和VPA1346转录情况 | 第37-38页 |
| 4 结果 | 第38-42页 |
| 4.1 VP和△VP0057在LBS和RPMI1640中的生长差异比较 | 第38页 |
| 4.2 VP0057促进副溶血弧菌粘附HeLa细胞 | 第38-41页 |
| 4.3 VP和△VP0057的生物被膜产量的差异比较 | 第41页 |
| 4.4 VP和△VP0057的T3SS1和T3SS2效应蛋白的表达差异比较 | 第41-42页 |
| 5 讨论 | 第42-44页 |
| 第四章 VP0057介导T3SS的蛋白质磷酸化修饰 | 第44-61页 |
| 1 前言 | 第44页 |
| 2 实验材料 | 第44-46页 |
| 2.1 菌株和质粒 | 第44页 |
| 2.2 主要试剂（盒） | 第44-45页 |
| 2.3 实验仪器 | 第45页 |
| 2.4 主要溶液配制 | 第45-46页 |
| 3 实验方法 | 第46-54页 |
| 3.1 VP0057抗体的制备 | 第46-50页 |
| 3.1.1 pET-28a(+)-VP0057重组表达载体的构建 | 第46-48页 |
| 3.1.1.1 VP0057基因的引物设计 | 第46页 |
| 3.1.1.2 VP0057基因的扩增 | 第46-47页 |
| 3.1.1.3 VP0057基因片段和pET-28a(+)质粒的双酶切 | 第47页 |
| 3.1.1.4 VP0057基因和pET-28a(+)质粒酶切片段连接 | 第47-48页 |
| 3.1.1.5 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备 | 第48页 |
| 3.1.1.6 连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞 | 第48页 |
| 3.1.1.7 重组质粒的pET28a(+)-VP0057的筛选和鉴定 | 第48页 |
| 3.1.2 VP0057诱导表达及纯化 | 第48-49页 |
| 3.1.2.1 VP0057蛋白的诱导表达 | 第49页 |
| 3.1.2.2 VP0057蛋白的纯化 | 第49页 |
| 3.1.3 VP0057抗血清的制备 | 第49-50页 |
| 3.1.3.1 VP0057抗原的制备 | 第50页 |
| 3.1.3.2 免疫小鼠 | 第50页 |
| 3.1.3.3 抗血清效价的检测 | 第50页 |
| 3.1.3.4 抗血清的获取 | 第50页 |
| 3.2 RT-PCR和WesternBlot检测VP0057转录情况 | 第50-53页 |
| 3.2.1 RT-PCR检测VP0057转录情况 | 第50-51页 |
| 3.2.1.1 RT-PCR引物设计 | 第50-51页 |
| 3.2.1.2 总RNA的反转录 | 第51页 |
| 3.2.1.3 RT-PCR检测VP0057转录情况 | 第51页 |
| 3.2.2 WesternBlot检测VP0057表达情况 | 第51-53页 |
| 3.2.2.1 蛋白样品制备及SDS-PAGE | 第52页 |
| 3.2.2.2 Western Blot | 第52-53页 |
| 3.3 VP和△VP0057全蛋白和膜蛋白中Ser、Thr磷酸化差异分析 | 第53-54页 |
| 3.3.1 蛋白样品制备及SDS-PAGE | 第53页 |
| 3.3.2 Western Blot | 第53-54页 |
| 4 结果 | 第54-59页 |
| 4.1 VP0057抗血清的制备 | 第54-57页 |
| 4.1.1 PCR扩增VP0057基因 | 第54页 |
| 4.1.2 重组质粒的鉴定 | 第54-55页 |
| 4.1.2.1 重组质粒的双酶切鉴定 | 第54-55页 |
| 4.1.2.2 重组质粒的测序鉴定 | 第55页 |
| 4.1.3 VP0057的诱导表达及纯化 | 第55-57页 |
| 4.1.4 Dot-Blot方法测定抗血清效价 | 第57页 |
| 4.2 RT-PCR检测VP中VP0057基因的转录表达情况 | 第57-58页 |
| 4.3 WesternBlot检测VP中VP0057表达情况 | 第58页 |
| 4.4 VP和△VP0057全蛋白和膜蛋白中Ser、Thr磷酸化差异分析 | 第58-59页 |
| 5 讨论 | 第59-61页 |
| 第五章 结论与展望 | 第61-62页 |
| 1 结论 | 第61页 |
| 2 展望 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
