| 致谢 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 1. 绪论 | 第12-22页 |
| ·生物催化的意义及研究进展 | 第12-14页 |
| ·短链脱氢酶超家族概述 | 第14-15页 |
| ·4-氯-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成 | 第15-16页 |
| ·非生物法 | 第15-16页 |
| ·微生物法 | 第16页 |
| ·酶法 | 第16页 |
| ·定点突变技术 | 第16-19页 |
| ·寡核苷酸引物介导的定点突变 | 第17-18页 |
| ·PCR介导的定点突变 | 第18页 |
| ·盒式突变 | 第18-19页 |
| ·酶耦联反应 | 第19-20页 |
| ·研究目的与内容 | 第20-22页 |
| 2 近平滑假丝酵母的短链脱氢酶基因(CPE)的克隆和表达 | 第22-49页 |
| ·引言 | 第22页 |
| ·材料与方法 | 第22-25页 |
| ·实验材料 | 第22-23页 |
| ·仪器及设备 | 第23页 |
| ·试剂 | 第23-24页 |
| ·主要溶液配制 | 第24-25页 |
| ·实验方法 | 第25-34页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第25-26页 |
| ·PCR引物的设计 | 第26页 |
| ·PCR反应 | 第26-27页 |
| ·PCR产物的回收 | 第27页 |
| ·CPE-T质粒的构建 | 第27-28页 |
| ·表达质粒的构建 | 第28-30页 |
| ·基因的表达与纯化 | 第30-33页 |
| ·COBE的转化反应 | 第33-34页 |
| ·结果与分析 | 第34-46页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第34页 |
| ·基因CPE的获得及测序结果 | 第34-36页 |
| ·CPE的表达 | 第36页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第36-37页 |
| ·纯化后的蛋白 | 第37-39页 |
| ·目的蛋白活性检测 | 第39-40页 |
| ·目的蛋白的酶学性质测定 | 第40-42页 |
| ·CPE对CHBE的转化反应 | 第42-46页 |
| ·讨论 | 第46-49页 |
| 3 近平滑假丝酵母的短链脱氢酶基因CPE的定点突变 | 第49-69页 |
| ·引言 | 第49页 |
| ·材料、仪器与试剂 | 第49-51页 |
| ·试验材料 | 第49页 |
| ·主要仪器及设备 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49-50页 |
| ·主要溶液配置 | 第50-51页 |
| ·实验所用程序及软件 | 第51页 |
| ·实验方法 | 第51-57页 |
| ·CPE序列分析 | 第51页 |
| ·氨基酸定点突变 | 第51-53页 |
| ·突变基因的获得 | 第53-54页 |
| ·突变基因表达载体的构建 | 第54-55页 |
| ·突变基因的表达 | 第55页 |
| ·突变蛋白表达产物的鉴定及蛋白浓度测定 | 第55页 |
| ·突变蛋白纯化 | 第55页 |
| ·突变蛋白与原蛋白底物谱的比较 | 第55页 |
| ·突变蛋白与蛋白转化效率及手性的比较 | 第55-57页 |
| ·突变蛋白反应体系的优化 | 第57页 |
| ·结果与分析 | 第57-67页 |
| ·CPE序列分析 | 第57-60页 |
| ·突变工程菌的构建 | 第60页 |
| ·突变蛋白的表达 | 第60-61页 |
| ·突变蛋白的纯化 | 第61-62页 |
| ·突变后蛋白与CPE性质比较 | 第62-65页 |
| ·突变后蛋白与CPE转化率比较 | 第65-66页 |
| ·部分突变蛋白的优化 | 第66-67页 |
| ·讨论 | 第67-69页 |
| 4 构建葡萄糖脱氢酶和短链脱氢酶的共表达体系 | 第69-85页 |
| ·引言 | 第69页 |
| ·材料、仪器与试剂 | 第69-71页 |
| ·试验材料 | 第69页 |
| ·主要仪器及设备 | 第69-70页 |
| ·主要试剂 | 第70页 |
| ·主要溶液配置 | 第70-71页 |
| ·试验方法 | 第71-74页 |
| ·葡萄糖脱氢酶质粒的获得 | 第71-72页 |
| ·CPE-PET21d质粒获得 | 第72页 |
| ·表达载体的构建 | 第72-73页 |
| ·重组基因的表达 | 第73页 |
| ·重组基因的蛋白表达 | 第73页 |
| ·共表达体系转化反应 | 第73-74页 |
| ·结果与分析 | 第74-84页 |
| ·葡萄糖脱氢酶质粒的获得 | 第74-75页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第75-77页 |
| ·重组基因的蛋白表达 | 第77-79页 |
| ·共表达体系的转化反应 | 第79-84页 |
| ·讨论 | 第84-85页 |
| 5 结论与展望 | 第85-87页 |
| ·结论 | 第85页 |
| ·近平滑假丝酵母Candida parapsilosis的短链脱氢酶基因的克隆和表达 | 第85页 |
| ·近平滑假丝酵母Candida parapsilosis的短链脱氢酶基因的定点突变 | 第85页 |
| ·构建葡萄糖脱氢酶和短链脱氢酶的共表达体系 | 第85页 |
| ·论文的创新与意义 | 第85-86页 |
| ·论文的展望 | 第86-87页 |
| 已发表论文 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-93页 |
