| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-16页 |
| 第1章 绪论 | 第16-34页 |
| ·课题背景与目的意义 | 第16-17页 |
| ·米曲霉的生物学特性及其在食品工业中的应用 | 第17-20页 |
| ·米曲霉的生物学特性 | 第17-18页 |
| ·米曲霉在食品工业中的应用 | 第18-19页 |
| ·国内外豆酱的工业生产方法及采用的菌种 | 第19-20页 |
| ·碱性蛋白酶的性质、应用及基因工程改性 | 第20-23页 |
| ·碱性蛋白酶的性质及应用 | 第20-22页 |
| ·碱性蛋白酶基因工程改性研究进展 | 第22-23页 |
| ·毕赤酵母表达系统研究进展 | 第23-26页 |
| ·毕赤酵母表达系统的特点 | 第23-25页 |
| ·影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素 | 第25-26页 |
| ·蛋白质三级结构预测及定向进化方法 | 第26-29页 |
| ·蛋白质三级结构预测 | 第26-28页 |
| ·蛋白质的定向进化方法 | 第28-29页 |
| ·基因打靶技术的研究进展 | 第29-33页 |
| ·基因打靶技术概述 | 第29-32页 |
| ·基因打靶技术的应用 | 第32-33页 |
| ·课题的主要研究内容 | 第33-34页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第34-62页 |
| ·实验材料 | 第34-37页 |
| ·菌株和质粒 | 第34页 |
| ·培养基 | 第34-35页 |
| ·酶和试剂 | 第35-36页 |
| ·实验主要仪器 | 第36-37页 |
| ·实验方法 | 第37-62页 |
| ·米曲霉菌种选育及发酵性能分析 | 第37-39页 |
| ·米曲霉碱性蛋白酶基因（alp）的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达 | 第39-49页 |
| ·重组碱性蛋白酶的纯化、酶学性质研究及其诱导条件的优化 | 第49-53页 |
| ·米曲霉碱性蛋白酶分子定向进化 | 第53-56页 |
| ·米曲霉碱性蛋白酶基因的遗传改造 | 第56-62页 |
| 第3章 米曲霉菌种选育及发酵性能分析 | 第62-72页 |
| ·紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株 | 第62-67页 |
| ·米曲霉产酶曲线的测定 | 第62-63页 |
| ·诱变出发菌株的选择 | 第63-64页 |
| ·诱变条件的选择 | 第64-65页 |
| ·紫外诱变初筛及复筛 | 第65-66页 |
| ·遗传稳定性测定 | 第66-67页 |
| ·米曲霉（A. oryzae）Y29 和3.042 的生物学特性及发酵性能分析 | 第67-71页 |
| ·生物学特性 | 第67-68页 |
| ·发酵性能分析 | 第68-71页 |
| ·本章小结 | 第71-72页 |
| 第4 章米曲霉碱性蛋白酶基因（alp）的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达 | 第72-90页 |
| ·米曲霉alp 基因的克隆与序列分析 | 第72-76页 |
| ·米曲霉总RNA 的提取 | 第72-73页 |
| ·RT-PCR 扩增米曲霉alp 基因 | 第73-74页 |
| ·米曲霉alp 基因的克隆和序列分析 | 第74-76页 |
| ·米曲霉alp 基因在毕赤酵母中的高效表达 | 第76-85页 |
| ·重组酵母表达载体的构建 | 第76-77页 |
| ·重组酵母表达载体的鉴定 | 第77页 |
| ·酵母转化子的获得 | 第77-78页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型筛选 | 第78-79页 |
| ·多拷贝整合的酵母转化子筛选 | 第79-80页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第80-81页 |
| ·重组毕赤酵母菌株的筛选 | 第81页 |
| ·米曲霉alp 基因在毕赤酵母中的高效表达和时间曲线研究 | 第81-83页 |
| ·重组米曲霉碱性蛋白酶的N 端氨基酸序列分析 | 第83-84页 |
| ·重组米曲霉碱性蛋白酶酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第84-85页 |
| ·米曲霉alp 基因的前导区对其在毕赤酵母表达中的必要性 | 第85-89页 |
| ·米曲霉碱性蛋白酶成熟肽编码基因（alp-m）的PCR 扩增 | 第85-86页 |
| ·重组表达质粒的构建和鉴定 | 第86页 |
| ·转化及高拷贝转化子的筛选 | 第86-87页 |
| ·表达产物的碱性蛋白酶活力测定和SDS-PAGE 分析 | 第87-88页 |
| ·转化子的Northern-blot 检测 | 第88-89页 |
| ·本章小结 | 第89-90页 |
| 第5章 重组碱性蛋白酶的纯化和酶学性质研究及其诱导条件的优化 | 第90-110页 |
| ·重组和天然米曲霉碱性蛋白酶的纯化及糖基化分析 | 第90-96页 |
| ·重组米曲霉碱性蛋白酶的纯化 | 第90-92页 |
| ·天然米曲霉碱性蛋白酶的纯化 | 第92-94页 |
| ·重组和天然米曲霉碱性蛋白酶的糖基化分析 | 第94-96页 |
| ·重组和天然米曲霉碱性蛋白酶的酶学性质研究 | 第96-100页 |
| ·最适反应温度 | 第96页 |
| ·最适反应pH | 第96-97页 |
| ·热稳定性 | 第97-98页 |
| ·pH 稳定性 | 第98-99页 |
| ·金属离子和蛋白酶抑制剂对酶活性的影响 | 第99-100页 |
| ·响应面法优化重组毕赤酵母表达米曲霉碱性蛋白酶诱导条件 | 第100-109页 |
| ·单因素实验结果 | 第100-102页 |
| ·Plackett-Burman 设计筛选影响重组米曲霉碱性蛋白酶表达的显著因素 | 第102-104页 |
| ·响应面法优化重组米曲霉碱性蛋白酶表达的诱导条件 | 第104-109页 |
| ·本章小结 | 第109-110页 |
| 第6章 米曲霉碱性蛋白酶分子定向进化 | 第110-126页 |
| ·米曲霉碱性蛋白酶三维结构的同源模建 | 第110-116页 |
| ·序列相似性搜索 | 第110-112页 |
| ·模体搜索 | 第112-114页 |
| ·结构域分析 | 第114-115页 |
| ·三维结构模建 | 第115-116页 |
| ·米曲霉碱性蛋白酶的定向进化 | 第116-125页 |
| ·突变位点的选择 | 第116-118页 |
| ·定点突变和表达载体的构建及序列测定 | 第118-119页 |
| ·突变的米曲霉碱性蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达及纯化 | 第119-120页 |
| ·突变酶的酶学性质比较 | 第120-125页 |
| ·本章小结 | 第125-126页 |
| 第7章 米曲霉碱性蛋白酶基因的遗传改造 | 第126-141页 |
| ·米曲霉alp 基因的敲除 | 第126-134页 |
| ·靶基因（米曲霉alp 基因）同源臂（A，B）序列的克隆 | 第126-129页 |
| ·含潮霉素B 抗性（hyg~r）基因的打靶载体pHC2 的构建 | 第129-130页 |
| ·利用打靶载体pHC2 敲除米曲霉alp 基因 | 第130-134页 |
| ·米曲霉（A. oryzae）Y31 工程菌株的获得 | 第134-139页 |
| ·构建含米曲霉碱性蛋白酶突变型G78D 基因的打靶载体pHC3. | 第134-135页 |
| ·利用pHC3 敲除米曲霉（A. oryzae）Y30 中hyg~r 基因 | 第135-137页 |
| ·米曲霉（A. oryzae）Y31 的蛋白酶活性和发酵性能分析 | 第137-139页 |
| ·本章小结 | 第139-141页 |
| 结论 | 第141-142页 |
| 参考文献 | 第142-157页 |
| 附录 | 第157-158页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第158-160页 |
| 致谢 | 第160-161页 |
| 个人简历 | 第161页 |
