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重组人骨形成蛋白-4在大肠杆菌中高效表达的研究

摘要第1-9页
Abstract第9-10页
英文缩略词第10-11页
第一章 绪论第11-25页
   ·决定外源基因在大肠杆菌中表达水平的因素第12-14页
   ·密码子偏好性对翻译顺利进行的重要意义第14页
   ·骨形成蛋白BMP-4简介第14-17页
     ·BMP-4基因结构第15-16页
     ·BMP-4基因的作用第16页
     ·BMP-4的蛋白质结构第16-17页
     ·BMP-4的理化性质第17页
     ·BMP-4的应用前景第17页
   ·包涵体的概述第17-21页
     ·包涵体的特性与形成过程第18-19页
     ·减少包涵体形成的策略第19页
     ·包涵体的变复性第19-21页
   ·表达质粒pET-3c简介第21-22页
   ·本研究的目的与主要内容第22-25页
     ·本研究的意义第22-23页
     ·本研究的主要内容第23-25页
第二章 实验材料与方法第25-37页
   ·主要仪器第25-26页
   ·材料第26-31页
     ·主要化学试剂第26-27页
     ·实验菌株与质粒第27页
     ·工具酶第27页
     ·分子量参照物第27页
     ·培养基第27页
     ·实验试剂第27-31页
     ·实验概况第31页
   ·实验方法第31-37页
     ·碱法小提质粒第31-32页
     ·琼脂糖凝胶电泳第32页
     ·DNA的酶切第32页
     ·体外连接第32页
     ·大肠杆菌感受态细胞的制备第32-33页
     ·转化第33页
     ·转化子的鉴定第33页
     ·SDS-PAGE第33-34页
     ·DEAE层析纯化包涵体第34页
     ·包涵体复性第34页
     ·复性后透析第34页
     ·免疫印迹检测第34-35页
     ·C2C12细胞传代第35页
     ·C2C12细胞上板(96孔板)第35页
     ·表达产物的生物活性测定第35-37页
第三章 高效表达rhBMP-4大肠杆菌GSH菌株的构建第37-48页
   ·表达质粒pET-rhBMP4的构建与鉴定第37-42页
     ·rhBMP-4引物的设计第37-38页
     ·rhBMP-4核苷酸序列的全基因合成第38-40页
     ·pET-rhBMP4重组质粒的构建第40-41页
     ·pET-rhBMP4的鉴定第41-42页
     ·测序第42页
   ·高效稳定表达rhBMP-4的工程菌株GSH的建立第42-44页
     ·诱导表达分析第42-43页
     ·高表达菌株筛选第43页
     ·重组质粒不稳定性研究—传代次数第43-44页
   ·本部分小结和讨论第44-48页
     ·rhBMP-4核苷酸序列的全基因合成第44-46页
     ·pET-3c/rhBMP-4表达载体的构建第46页
     ·高表达菌株的获得第46-48页
第四章:GSH菌株发酵条件的优化第48-62页
   ·重组大肠杆菌GSH菌株的生长曲线第48-49页
   ·不同培养条件对GSH菌株生长的影响第49-54页
     ·溶氧量对GSH菌株生长的影响第49页
     ·不同接种量对菌体生长的影响第49-50页
     ·IPTG对菌体生长的影响第50-51页
     ·不同碳源对菌体生长的影响第51-54页
     ·酵母提取物与蛋白胨比例对菌体生长的影响第54页
   ·不同培养条件对rhBMP-4表达的影响第54-58页
     ·不同接种量对rhBMP-4表达的影响第54-55页
     ·不同摇瓶装液量对rhBMP-4表达的影响第55页
     ·IPTG对rhBMP-4表达的影响第55-57页
     ·不同碳源对rhBMP-4表达的影响第57-58页
     ·酵母提取物/蛋白胨比例与rhBMP-4表达第58页
   ·本部分小结与讨论第58-62页
     ·不同培养条件对GSH菌株生长的影响第58-60页
     ·不同培养条件对rhBMP-4表达的影响第60-62页
第五章 rhBMP-4的复性摸索及活性检测第62-69页
   ·菌体的获得与清洗第62-63页
   ·rhBMP-4单体的离子交换层析纯化第63页
     ·包涵体溶解第63页
     ·梯度洗脱第63页
   ·包涵体的复性第63-64页
     ·用溶解液Ⅱ溶解蛋白沉淀第63-64页
     ·用稀释法进行复性第64页
   ·复性后rhBMP-4的活性分析第64-66页
     ·rhBMP-4的理化性质鉴定第64-65页
     ·碱性磷酸酶(ALP)表达量检测第65-66页
     ·诱骨活性的测定第66页
   ·本部分小结和讨论第66-69页
     ·rhBMP-4纯化条件的摸索第66-67页
     ·rhBMP-4复性后样品的处理和活性检测第67-69页
第六章 实验的创新与展望第69-71页
   ·本实验的创新点第69页
   ·展望第69-71页
参考文献第71-77页
附录第77-81页
致谢第81页

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