| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 英文缩写 | 第5-10页 |
| 图表目录 | 第10-13页 |
| 一、引言 | 第13-33页 |
| 1. 端粒和端粒酶的研究历史 | 第13-15页 |
| 2. 端粒结合蛋白与端粒长度调控 | 第15-25页 |
| ·双链结合蛋白 | 第15-22页 |
| ·TRF1 及其调控蛋白 | 第15-20页 |
| ·TRF1 (telomeric-repeat binding factor 1) | 第15-16页 |
| ·TRF1 的调控蛋白 | 第16-20页 |
| ·Pin2 (NIMA-interacting protein 2) | 第16-18页 |
| ·端锚ADP核糖聚合酶Tankyrase (TRF1 interacting ankyrin related ADP ribose polymerase) | 第18-19页 |
| ·TIN2 (TRF1-interacting nuclear factor2 | 第19页 |
| ·PinX1 (Pin2/TRF1-interacting protein | 第19-20页 |
| ·TRF2 及有关端粒结合蛋白 | 第20-22页 |
| ·TRF2 (telomeric-repeat binding factor 2) | 第20页 |
| ·调节TRF2 的蛋白 | 第20-22页 |
| ·hRAP1 (human repressor-activator protein 1) | 第20-21页 |
| ·BLM和WRN | 第21页 |
| ·核内不均一核糖核蛋白 | 第21页 |
| ·Rad50/Mre11/Nbs1 | 第21-22页 |
| ·DNA依赖的蛋白激酶和Ku蛋白 | 第22页 |
| 2. 2 单链结合蛋白 | 第22-25页 |
| 2. 2. 1 端粒末端保护蛋白 1 | 第22-24页 |
| 2. 2. 2 其它物种的端粒单链DNA结合蛋白 | 第24-25页 |
| 3. 端粒酶及其活性调控 | 第25-29页 |
| ·表达调控 | 第27页 |
| ·活性调控 | 第27-29页 |
| ·hTERT与 14-3-3 | 第27-28页 |
| ·hTERT 与HSP90 | 第28-29页 |
| ·hTERT 与Ku | 第29页 |
| 4. 解旋酶与端粒复制调控 | 第29-31页 |
| 5. Pif1 解旋酶亚家族 | 第31-33页 |
| 二、 材料与方法 | 第33-51页 |
| 1. 人Pif1 cDNA的克隆与亚克隆 | 第33页 |
| 2. 制备并纯化抗体 | 第33-35页 |
| 3. hPif1 融合蛋白在酵母中的表达和纯化 | 第35-36页 |
| ·构建酵母表达载体pEG(KT)-hPif1ΔN及pEG(KT)-hPif1~(K234A)ΔN | 第35-36页 |
| ·GST融合蛋白在酵母表达系统中的小量纯化 | 第36页 |
| 4. DNA/RNA解旋酶活性测试 | 第36-37页 |
| 5. 稳定表达株筛选 | 第37-38页 |
| ·转染用的质粒的制备 | 第37页 |
| ·磷酸钙法转染细胞 | 第37页 |
| ·筛选稳定转染株 | 第37-38页 |
| 6. 可诱导的基因表达系统 | 第38页 |
| 7. 细胞传代培养 | 第38页 |
| 8. 免疫沉淀 | 第38-39页 |
| 9. MTT比色法测定细胞生长速率 | 第39页 |
| 10. FACS法细胞凋亡分析 | 第39页 |
| 11. Northern分析 | 第39-41页 |
| ·样品总 RNA 的抽提 | 第39-40页 |
| ·polyA~+ mRNA的分离 | 第40页 |
| ·Northern blot 杂交 | 第40-41页 |
| 12. 端粒DNA印记杂交及端粒长度测定 | 第41-43页 |
| ·抽提基因组DNA | 第41页 |
| ·限制性酶切、消化基因组DNA与电泳分离 | 第41-42页 |
| ·Southern转移 | 第42页 |
| ·预杂交和杂交 | 第42页 |
| ·脉冲场电泳-端粒Southern印记 | 第42-43页 |
| 13. 利用GFP融合蛋白进行细胞定位研究 | 第43页 |
| ·基因转染及细胞铺片的制备 | 第43页 |
| ·hPif1 在转染细胞中表达的检测 | 第43页 |
| 14. 细胞免疫荧光 | 第43-44页 |
| 15. 染色质免疫沉淀(ChIP) | 第44-45页 |
| 16. 细胞核蛋白的制备 | 第45页 |
| 17. 体内泛素化试验 | 第45页 |
| 18. Beta-半乳糖苷酶检测系统 | 第45页 |
| 19. 基于端粒重复序列扩增法端粒酶体外抑制试验 | 第45-46页 |
| 20. 人端粒酶体外重建 | 第46页 |
| 21. 端粒酶直接测活试验 | 第46-47页 |
| 22. hPif1 蛋白的种系进化分析 | 第47页 |
| 23. 引物与寡核苷酸序列 | 第47-51页 |
| 三、结果 | 第51-91页 |
| 1. 人Pif1 全长cDNA的克隆 | 第51页 |
| 2. 人Pif1 蛋白是一种的大肠杆菌RecD同源蛋白 | 第51-55页 |
| 3. 人Pif1 蛋白的四种多克隆抗体的制备 | 第55-59页 |
| 4. 人Pif1 基因在端粒酶阳性细胞株中表达,但在端粒酶阴性细胞无表达 | 第59-63页 |
| 5. 人Pif1 蛋白具有 5’至 3’的DNA解旋酶活性 | 第63页 |
| 6. 细胞中Pif1 蛋白水平受泛素介导的蛋白质降解系统调控 | 第63-65页 |
| 7. 过表达hPif1 不影响细胞的生长 | 第65-72页 |
| 8. 过表达有ATP酶/解旋酶活性的hPif1 导致端粒的缩短 | 第72-78页 |
| 9. 抑制hPif1 的表达可恢复端粒的长度 | 第78-80页 |
| 10. hPif1 在体内通过抑制端粒酶通路抑制端粒的延伸 | 第80页 |
| 11. hPif1 在体外抑制端粒酶的活性 | 第80-83页 |
| 12. 人Pif1 蛋白在体外降低端粒酶的进行性 (与周波合作的工作) | 第83页 |
| 13. 人Pif1 蛋白具有RNA/DNA解旋酶活性 | 第83-87页 |
| 14. 在体内和体外,hPif1 蛋白与端粒DNA结合 | 第87-91页 |
| 四、讨论 | 第91-102页 |
| 1. 人Pif1 研究工作的总结 | 第91页 |
| 2. Pif1 亚家族与RecD亚家族 | 第91-93页 |
| 3. 真核生物的RecBCD同源物的探寻 | 第93-95页 |
| 4. 人Pif1 蛋白与酵母Pif1 蛋白 | 第95-96页 |
| 5.Pif1 解旋酶亚家族成员大多参与端粒复制调控 | 第96-97页 |
| 6.hPif1 抑制端粒酶活性的分子机理 | 第97页 |
| 7.端粒酶活性调控的进展 | 第97-99页 |
| 8.解旋酶参与端粒酶活性调控 | 第99页 |
| 9.人Pif1 基因与人类疾病 | 第99页 |
| 10. 展望 | 第99-102页 |
| 五、 参考文献 | 第102-117页 |
| 六、 发表研究论文 | 第117页 |
| 七、 在读期间申请的专利 | 第117页 |
| 八、 参加国内国际会议 | 第117-118页 |
| 九、 获奖 | 第118-119页 |
| 十、 致谢 | 第119-120页 |
