| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 1 引言 | 第13-34页 |
| 1．1 植物基因克隆及植物基因差异表达分析方法的研究进展 | 第13-19页 |
| 1．1．1 植物基因克隆方法的研究进展 | 第13-15页 |
| 1．1．2 植物基因差异表达分析方法的研究进展 | 第15-19页 |
| 1．2 植物全长基因的获得方法的研究进展 | 第19-21页 |
| 1．2．1 基因文库筛选 | 第19页 |
| 1．2．2 载体引物法 | 第19页 |
| 1．2．3 固相支持物法 | 第19页 |
| 1．2．4 RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术 | 第19-21页 |
| 1．3 EST表达谱分析研究进展 | 第21-23页 |
| 1．3．1 大豆EST计划研究进展 | 第21页 |
| 1．3．2 EST在基因表达谱研究中的应用 | 第21-23页 |
| 1．4 生物信息学策略 | 第23-25页 |
| 1．4．1 基因组计划与生物信息学 | 第23页 |
| 1．4．2 生物数据库 | 第23-24页 |
| 1．4．3 生物信息学的应用前景 | 第24-25页 |
| 1．5 大豆花叶病毒病的研究进展 | 第25-32页 |
| 1．5．1 SMV特性与株系划分 | 第25-26页 |
| 1．5．2 症状及抗感鉴定标准 | 第26页 |
| 1．5．3 发病影响因素及流行学研究 | 第26-27页 |
| 1．5．4 抗性遗传研究 | 第27-29页 |
| 1．5．5 抗源筛选和抗病育种 | 第29-30页 |
| 1．5．6 生理生化抗性机制 | 第30-31页 |
| 1．5．7 分子生物学研究进展 | 第31-32页 |
| 1．6 大豆病毒病研究存在的问题 | 第32-33页 |
| 1．6．1 育种手段需要更新，传统杂交育种应该与生物技术相结合 | 第32-33页 |
| 1．6．2 研究方向的局限性 | 第33页 |
| 1．7 研究目的与意义 | 第33-34页 |
| 2 材料和方法 | 第34-60页 |
| 2．1 抑制性消减杂交(SSH)及消减文库构建 | 第34-45页 |
| 2．1．1 实验材料 | 第34页 |
| 2．1．2 实验方法 | 第34-42页 |
| 2．1．3 消减文库构建及EST序列分析 | 第42-45页 |
| 2．2 大豆抗病毒相关基因SR-EF全长cDNA的获得 | 第45-49页 |
| 2．2．1 实验材料 | 第45页 |
| 2．2．2 实验方法 | 第45-49页 |
| 2．3 SR-EF基因在东农8143基因组中的扩增 | 第49-52页 |
| 2．3．1 实验材料 | 第50页 |
| 2．3．2 实验方法 | 第50-52页 |
| 2．4 大豆SR-EF基因的转录表达检测 | 第52-53页 |
| 2．4．1 实验材料 | 第52页 |
| 2．4．2 实验方法 | 第52-53页 |
| 2．5 大豆SR-EF基因连接介导的染色体步行 | 第53-55页 |
| 2．5．1 实验材料 | 第53页 |
| 2．5．2 实验方法 | 第53-55页 |
| 2．6 SR-EF基因Southern blotting检测 | 第55-60页 |
| 2．6．1 实验材料 | 第55页 |
| 2．6．2 实验方法 | 第55-60页 |
| 3 结果与分析 | 第60-86页 |
| 3．1 消减文库构建 | 第60-63页 |
| 3．1．1 total RNA提取 | 第60页 |
| 3．1．2 mRNA纯化 | 第60-61页 |
| 3．1．3 双链cDNA合成 | 第61页 |
| 3．1．4 Tester酶切 | 第61-62页 |
| 3．1．5 消减杂交 | 第62页 |
| 3．1．6 PCR产物纯化与连接 | 第62页 |
| 3．1．7 连接转化与质粒文库滴度计算 | 第62-63页 |
| 3．1．8 质粒提取结果 | 第63页 |
| 3．2 表达谱分析 | 第63-71页 |
| 3．2．1 序列测定 | 第63页 |
| 3．2．2 表达谱分析 | 第63-64页 |
| 3．2．3 基因聚类分析 | 第64-70页 |
| 3．2．4 CY88测序及同源性比较 | 第70-71页 |
| 3．3 大豆SR-EF-1基因全长cDNA的获得 | 第71-76页 |
| 3．3．1 CY88 5’RACE第一次PCR扩增 | 第71-72页 |
| 3．3．2 CY88 5' RACE巢式PCR扩增 | 第72页 |
| 3．3．3 质粒提取结果 | 第72页 |
| 3．3．4 质粒的酶切鉴定 | 第72-73页 |
| 3．3．5 5' RACE测序 | 第73-74页 |
| 3．3．6 全长cDNA的克隆 | 第74-76页 |
| 3．4 基因组DNA的PCR扩增 | 第76-77页 |
| 3．4．1 基因组DNA的PCR扩增 | 第76页 |
| 3．4．2 DNA扩增产物的克隆 | 第76页 |
| 3．4．3 SR-EF-1和G-SR-EF-1基因全长比较 | 第76-77页 |
| 3．5 SR-EF-1基因RT-PCR分析 | 第77-78页 |
| 3．5．1 RT-PCR扩增 | 第77-78页 |
| 3．5．2 RT-PCR结果分析 | 第78页 |
| 3．6 SR-EF-1基因连接介导PCR | 第78-83页 |
| 3．6．1 LM-PCR第一次PCR扩增 | 第78-79页 |
| 3．6．2 LM-PCR第二次PCR扩增 | 第79页 |
| 3．6．3 质粒提取结果 | 第79-80页 |
| 3．6．4 质粒的酶切鉴定 | 第80页 |
| 3．6．5 LM-PCR测序 | 第80-83页 |
| 3．7 DNA杂交(Southern Blot) | 第83-86页 |
| 3．7．1 DNA的提取及纯化 | 第83-84页 |
| 3．7．2 DNA的限制性内切酶酶切 | 第84页 |
| 3．7．3 Southern Blot | 第84-86页 |
| 4 讨论 | 第86-90页 |
| 4．1 实验选材与方法选择 | 第86-87页 |
| 4．1．1 实验选材 | 第86页 |
| 4．1．2 方法选择 | 第86-87页 |
| 4．2 SSH与RACE结合的优越性 | 第87页 |
| 4．3 抗病相关基因 | 第87-88页 |
| 4．4 大豆SR-EF-2基因的结构特点及可能的作用机制 | 第88-89页 |
| 4．5 关于后续工作 | 第89-90页 |
| 5 结论 | 第90-92页 |
| 5．1 大豆花叶病毒病(SMV)抗病相关基因消减文库构建 | 第90页 |
| 5．2 EST表达谱分析 | 第90页 |
| 5．3 SR-EF-1及SR-EF-2基因的克隆 | 第90-91页 |
| 5．4 SR-EF-1基因的特性 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-103页 |
| 攻读硕士学位期间所发表的学术论文 | 第103页 |
