| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| *缩略词 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-19页 |
| 第一章 虫草素合成关键酶基因RNR克隆与重组质粒的构建 | 第19-35页 |
| 1.材料 | 第19-21页 |
| 1.1 实验材料 | 第19-20页 |
| 1.2 实验试剂 | 第20页 |
| 1.3 试剂及培养基配置 | 第20-21页 |
| 1.4 实验设备 | 第21页 |
| 2.实验方法 | 第21-30页 |
| 2.1 载体构建 | 第21-23页 |
| 2.2 冬虫夏草子实体总RNA的提取与cDNA反转录 | 第23-24页 |
| 2.2.1 冬虫夏草子实体总RNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.2.2 反转录cDNA | 第24页 |
| 2.3 冬虫夏草子实体RNRL、RNRM基因与35S启动子基因的克隆 | 第24-25页 |
| 2.3.1 目的片段扩增 | 第24-25页 |
| 2.3.2 目的片段回收 | 第25页 |
| 2.4 RNRL、35S1基因与载体的酶切与连接 | 第25-27页 |
| 2.4.1 RNRL、35S1基因与载体双酶切 | 第25-26页 |
| 2.4.2 RNRL、35S1基因与载体连接 | 第26-27页 |
| 2.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化 | 第27-28页 |
| 2.5.1 大肠杆菌(DH5α)感受态细胞的制备 | 第27页 |
| 2.5.2 大肠杆菌转化 | 第27-28页 |
| 2.6 阳性转化子鉴定与测序 | 第28页 |
| 2.7 pCAMBIA1300-35S1-RNRL、pCAMBIA1300-35S1-RNRM载体的构建 | 第28-30页 |
| 2.7.1 pCAMBIA1300-35S1、pCAMBIA1300-RNRL质粒提取 | 第28页 |
| 2.7.2 RNRM、35S1与相应载体双酶切与连接 | 第28-29页 |
| 2.7.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化 | 第29页 |
| 2.7.4 pCAMBIA1300-35S-RNRL、pCAMBIA1300-35S-RNRM载体的鉴定 | 第29-30页 |
| 2.8 pCAMBIA1300-35S1-RNRM-35S2-RNRL载体的构建 | 第30页 |
| 3.结果与分析 | 第30-33页 |
| 3.1 冬虫夏草总RNA提取 | 第30-31页 |
| 3.2 RNRL、RNRM、35S1、35S2基因的克隆 | 第31页 |
| 3.3 各重组质粒菌落PCR鉴定结果 | 第31-33页 |
| 4.讨论 | 第33-35页 |
| 第二章 蛹虫草菌遗传转化体系构建 | 第35-52页 |
| 1.材料 | 第35-38页 |
| 1.1 实验材料 | 第35页 |
| 1.2 实验试剂 | 第35-36页 |
| 1.3 试剂配置 | 第36-38页 |
| 1.4 实验设备 | 第38页 |
| 2.方法 | 第38-43页 |
| 2.1 根癌农杆菌感受态细胞转化 | 第38-39页 |
| 2.1.1 根癌农杆菌(EHA105)感受态制备 | 第39页 |
| 2.1.2 根癌农杆菌感受态细胞转化 | 第39页 |
| 2.2 根癌农杆菌介导蛹虫草转化 | 第39-40页 |
| 2.2.1 蛹虫草孢子的获取 | 第39-40页 |
| 2.2.2 蛹虫草、根癌农杆菌的抗生素敏感性实验 | 第40页 |
| 2.2.3 根癌农杆菌介导蛹虫草转化 | 第40页 |
| 2.3 转化子鉴定 | 第40-41页 |
| 2.3.1 转化子总DNA的提取 | 第40-41页 |
| 2.3.2 重组蛹虫草菌的PCR鉴定 | 第41页 |
| 2.4 重组蛹虫草菌RNRL、RNRM基因荧光定量PCR检测 | 第41-42页 |
| 2.5 重组蛹虫草菌RNRL、RNRM蛋白Western Blot检测 | 第42-43页 |
| 3.结果与分析 | 第43-50页 |
| 3.1 根癌农杆菌转化子鉴定 | 第43-44页 |
| 3.2 蛹虫草孢子显微图 | 第44-45页 |
| 3.3 根癌农杆菌、蛹虫草孢子抗生素敏感性结果 | 第45-46页 |
| 3.4 蛹虫草阳性转化子PCR鉴定 | 第46页 |
| 3.5 实时荧光定量PCR | 第46-50页 |
| 3.6 Western Blot检测分析 | 第50页 |
| 4.讨论 | 第50-52页 |
| 第三章 蛹虫草转化子虫草素含量检测 | 第52-61页 |
| 1 材料 | 第52-53页 |
| 1.1 实验材料 | 第52页 |
| 1.2 实验试剂 | 第52页 |
| 1.3 实验仪器 | 第52-53页 |
| 2 方法 | 第53-54页 |
| 2.1 样品制备 | 第53页 |
| 2.1.1 对照品溶液的制备 | 第53页 |
| 2.1.2 供试品溶液的制备 | 第53页 |
| 2.2 色谱条件 | 第53-54页 |
| 2.3 虫草素标准曲线的制备 | 第54页 |
| 2.4 方法学考察 | 第54页 |
| 2.4.1 精密度试验 | 第54页 |
| 2.4.2 稳定性试验 | 第54页 |
| 2.4.3 加样回收试验 | 第54页 |
| 2.5 虫草素含量测定 | 第54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-59页 |
| 3.1 虫草素标准曲线 | 第54-55页 |
| 3.2 精密度试验 | 第55页 |
| 3.3 稳定性试验 | 第55-56页 |
| 3.4 加样回收试验 | 第56页 |
| 3.5 虫草素含量测定结果与分析 | 第56-59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 结论 | 第61-62页 |
| 文献综述 中药有效成分生物合成的研究进展 | 第62-68页 |
| 1 中药基因组学 | 第62-64页 |
| 1.1 中药转录组学研究 | 第62页 |
| 1.2 结构基因组学研究 | 第62-63页 |
| 1.3 中药基因组标记研究 | 第63页 |
| 1.4 中药功能基因组学研究 | 第63-64页 |
| 2 中药有效成分生物合成 | 第64-68页 |
| 2.1 中药生物合成研究简介 | 第64-65页 |
| 2.2 遗传转化体系构建的研究 | 第65-66页 |
| 2.2.1 根癌农杆菌介导的丝状真菌的遗传转化研究 | 第65页 |
| 2.2.2 根癌农杆菌介导转化的机理 | 第65-66页 |
| 2.2.3 根癌农杆菌介导真菌遗传转化步骤 | 第66页 |
| 2.3 中药生物合成研究的应用 | 第66-68页 |
| 2.3.1 青蒿素前体生物合成的研究 | 第66-67页 |
| 2.3.2 人参皂苷生物合成的研究 | 第67页 |
| 2.3.3 丹参酮生物合成的研究 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果 | 第74-75页 |
