| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 目录 | 第11-14页 |
| 中英文对照和缩略语表 | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-41页 |
| 1.1 引言 | 第15-16页 |
| 1.2 血糖检测用酶 | 第16-29页 |
| 1.2.1 葡萄糖氧化酶 | 第16-20页 |
| 1.2.2 NAD-GDH | 第20-21页 |
| 1.2.3 PQQ-GDH | 第21-27页 |
| 1.2.4 FAD-GDH | 第27-29页 |
| 1.3 外源蛋白在大肠杆菌中的可溶表达策略 | 第29-35页 |
| 1.3.1 培养基成分 | 第29页 |
| 1.3.2 表达宿主的选择 | 第29-30页 |
| 1.3.3 融合标签 | 第30-31页 |
| 1.3.4 分子伴侣系统共同表达 | 第31-35页 |
| 1.4 结构生物学简介 | 第35-39页 |
| 1.4.1 X-ray 晶体学测定蛋白质结构概论 | 第37页 |
| 1.4.2 核磁共振波谱学（NMR）简介 | 第37-38页 |
| 1.4.3 电子显微三维重构技术简介 | 第38-39页 |
| 1.5 本论文的主要内容及研究意义 | 第39-41页 |
| 第二章 重组 FAD-GDH 的真核表达、纯化 | 第41-59页 |
| 2.1 引言 | 第41页 |
| 2.2 材料与方法 | 第41-48页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第41-44页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第44-48页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第48-58页 |
| 2.3.1 FAD-GDH 基因的扩增 | 第48页 |
| 2.3.2 重组质粒 pPIC9K-FAD-GDH 的构建、鉴定及线性化 | 第48-50页 |
| 2.3.3 重组毕赤酵母 P. pastoris GS115/FAD-GDH 构建及鉴定 | 第50页 |
| 2.3.4 高表达 P. pastoris GS115/FAD-GDH 菌株筛选 | 第50-51页 |
| 2.3.5 FAD-GDH 小量表达优化 | 第51-53页 |
| 2.3.6 FAD-GDH 的上罐发酵 | 第53-54页 |
| 2.3.7 FAD-GDH 分离纯化 | 第54-58页 |
| 2.4 本章小结 | 第58-59页 |
| 第三章 重组 FAD-GDH 的原核表达、纯化 | 第59-73页 |
| 3.1 引言 | 第59页 |
| 3.2 材料与方法 | 第59-64页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第59-61页 |
| 3.2.2 实验方法 | 第61-64页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第64-71页 |
| 3.3.1 FAD-GDH 基因的扩增 | 第64-66页 |
| 3.3.2 FAD-GDH 可溶表达菌株的筛选 | 第66-67页 |
| 3.3.3 小量表达优化 | 第67-68页 |
| 3.3.4 渗透压对 FAD-GDH 可溶表达的影响 | 第68-69页 |
| 3.3.5 FAD-GDH 大量表达和纯化 | 第69-71页 |
| 3.4 本章小结 | 第71-73页 |
| 第四章 重组 FAD-GDH 的酶学性质研究 | 第73-85页 |
| 4.1 引言 | 第73-74页 |
| 4.2 材料与方法 | 第74-75页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第74页 |
| 4.2.2 实验方法 | 第74-75页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第75-83页 |
| 4.3.1 FAD-GDH 最适反应 pH 值测定 | 第75-76页 |
| 4.3.2 FAD-GDH 最适反应温度的确定 | 第76-77页 |
| 4.3.3 FAD-GDH pH 值稳定性检测 | 第77-79页 |
| 4.3.4 FAD-GDH 的热稳定性检测 | 第79-80页 |
| 4.3.5 FAD-GDH 的酶促反应动力学性质 | 第80页 |
| 4.3.6 FAD-GDH 全波长扫描 | 第80-81页 |
| 4.3.7 FAD-GDH 分子筛测定 | 第81-82页 |
| 4.3.8 FAD-GDH 底物专一性检测 | 第82-83页 |
| 4.3.9 FAD-GDH 氧化酶活性检测 | 第83页 |
| 4.4 本章小结 | 第83-85页 |
| 第五章 FAD-GDH 结晶和结构解析 | 第85-97页 |
| 5.1 引言 | 第85-86页 |
| 5.2 材料与方法 | 第86-88页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第86-87页 |
| 5.2.2 实验方法 | 第87-88页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第88-96页 |
| 5.3.1 FAD-GDH 结晶条件初筛 | 第88-89页 |
| 5.3.2 FAD-GDH 结晶条件优化 | 第89-90页 |
| 5.3.3 FAD-GDH 晶体冷冻保护剂筛选 | 第90页 |
| 5.3.4 衍射数据采集和处理 | 第90-92页 |
| 5.3.5 FAD-GDH 结构解析 | 第92-93页 |
| 5.3.6 FAD-GDH 结构分析 | 第93-95页 |
| 5.3.7 FAD-GDH 复合物晶体生长和结构解析 | 第95-96页 |
| 5.4 本章小结 | 第96-97页 |
| 第六章 FAD-GDH 底物专一性改造 | 第97-115页 |
| 6.1 引言 | 第97-98页 |
| 6.2 材料与方法 | 第98-99页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第98-99页 |
| 6.2.2 实验方法 | 第99页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第99-113页 |
| 6.3.1 定点突变原理 | 第99-100页 |
| 6.3.2 FAD-GDH 与 GOD 的结构比较 | 第100-101页 |
| 6.3.3 FAD-GDH 活性中心的确定 | 第101-102页 |
| 6.3.4 FAD-GDH 和 D-葡萄糖结合模型的建立 | 第102-103页 |
| 6.3.5 FAD-GDH 底物专一性改造 | 第103-113页 |
| 6.4 本章小结 | 第113-115页 |
| 结论与展望 | 第115-119页 |
| 结论 | 第115-116页 |
| 论文创新性 | 第116-117页 |
| 展望 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-129页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第129-131页 |
| 致谢 | 第131-133页 |
| 附件 | 第133页 |
