| 中文摘要 | 第9-13页 |
| 英文摘要 | 第13-16页 |
| 缩略语/符号说明 | 第17-19页 |
| 前言 | 第19-22页 |
| 第一部分 miRNA-509抑制TSCC增殖、迁移及侵袭的体外实验研究 | 第22-41页 |
| 材料与方法 | 第22-36页 |
| 1 实验材料 | 第22-23页 |
| 1.1 主要试剂及耗材 | 第22-23页 |
| 1.2 主要仪器 | 第23页 |
| 2. 实验方法 | 第23-36页 |
| 2.1 临床样本收集 | 第24页 |
| 2.1.1 研究纳入标准 | 第24页 |
| 2.1.2. 样本收集 | 第24页 |
| 2.2 qRT-PCR检测miR-509在TSCC组织和正常癌旁组织中的表达 | 第24-27页 |
| 2.2.1 组织总RNA提取 | 第24-25页 |
| 2.2.2 测定RNA纯度和含量 | 第25页 |
| 2.2.3 逆转录反应(RT) | 第25-26页 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR检测 | 第26-27页 |
| 2.2.5 RT-PCR结果的定量分析 | 第27页 |
| 2.3 细胞培养 | 第27-28页 |
| 2.4 qRT-PCR检测miR-509在人舌癌细胞系和正常牙龈细胞中的表达 | 第28-30页 |
| 2.4.1 细胞RNA的提取 | 第28页 |
| 2.4.2 测RNA浓度,并分装保存 | 第28-29页 |
| 2.4.3 逆转录反应(RT) | 第29页 |
| 2.4.4 实时荧光定量PCR检测 | 第29-30页 |
| 2.4.5 RT-PCR结果的定量分析 | 第30页 |
| 2.5 96孔板(Tca-8113,Cal-27)细胞转染 | 第30-31页 |
| 2.6 qRT-PCR检测转染miR-509mimics和miR-NC后miR-509在细胞中的表达 | 第31-34页 |
| 2.6.1 细胞RNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.6.2 测RNA浓度,并分装保存 | 第32页 |
| 2.6.3 逆转录反应(RT) | 第32-33页 |
| 2.6.4 实时荧光定量PCR检测 | 第33-34页 |
| 2.6.5 RT-PCR结果的定量分析 | 第34页 |
| 2.7 MTT实验检测细胞增殖 | 第34页 |
| 2.8 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 | 第34-36页 |
| 2.9 统计学处理 | 第36页 |
| 3. 结果 | 第36-37页 |
| 3.1 miR-509在TSCC组织及细胞中表达下调 | 第36页 |
| 3.2 Tca8113和Cal-27细胞转染miR-509, qRT-PCR检测miR-509 mRNA表达上调 | 第36-37页 |
| 3.3 miR-509抑制细胞增殖 | 第37页 |
| 3.4 miR-509抑制Tca8113,Cal-27细胞迁移和侵袭 | 第37页 |
| 4 讨论 | 第37-38页 |
| 5 小结 | 第38-39页 |
| 附图 | 第39-41页 |
| 第二部分 鉴定直接靶向miR-509的靶基因 | 第41-59页 |
| 材料与方法 | 第41-49页 |
| 1 实验材料 | 第41-43页 |
| 1.1 主要试剂及耗材 | 第41-42页 |
| 1.2 主要仪器 | 第42-43页 |
| 技术路线 | 第43页 |
| 2. 实验方法 | 第43-49页 |
| 2.1 细胞培养 | 第43页 |
| 2.2 计算机预测miR-509的靶基因 | 第43页 |
| 2.3 细胞转染 | 第43-44页 |
| 2.4 qRT-PCR检测转染miR-509 mimics和miR-NC的Tca8113, CAL-27细胞中EGFR mRNA的表达 | 第44页 |
| 2.5 Western blot实验检测转染细胞Tca8113, CAL-27中EGFR, AKT, ERK1/2,P-AKT, P-ERK1/2蛋白的表达 | 第44-46页 |
| 2.5.1 细胞总蛋白提取 | 第44页 |
| 2.5.2 蛋白含量的测定 | 第44-45页 |
| 2.5.3 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第45页 |
| 2.5.4 转膜(半干转） | 第45页 |
| 2.5.5 封闭、抗原抗体反应 | 第45-46页 |
| 2.5.6 化学发光法检测 | 第46页 |
| 2.6 质粒和miRNA-509模拟剂共转染实验(96孔板转染体系) | 第46页 |
| 2.7 双荧光素酶报告实验 | 第46-47页 |
| 2.8 MTT实验检测细胞增殖 | 第47页 |
| 2.9 细胞侵袭实验 | 第47页 |
| 2.10 qRT-PCR检测舌癌组织及正常对照组织中EGFR mRNA的表达 | 第47-49页 |
| 2.10.1 按第一部分2.2.1中所述方法提取组织总RNA。 | 第47页 |
| 2.10.2 mRNA逆转录反应(RT) | 第47-48页 |
| 2.10.3 mRNA qRT-PCR | 第48-49页 |
| 2.11 统计学处理 | 第49页 |
| 3 结果 | 第49-51页 |
| 3.1 miR-509靶基因预测 | 第49-50页 |
| 3.2 miR-509下调TSCC细胞中EGFR表达 | 第50页 |
| 3.3 si-EGFR抑制TSCC细胞增殖 | 第50页 |
| 3.4 si-EGFR抑制Tca8113,Cal-27细胞迁移和侵袭 | 第50-51页 |
| 3.5 EGFR mRNA3'UTR端是miR-509的直接靶点 | 第51页 |
| 3.6 EGFR mRNA和mir-509在TSCC组织中反向表达 | 第51页 |
| 3.7 miR-509抑制TSCC中EGFR及下游信号通路 | 第51页 |
| 4 讨论 | 第51-54页 |
| 5 小结 | 第54页 |
| 附图 | 第54-59页 |
| 参考文献 | 第59-65页 |
| 致谢 | 第65-67页 |
| 博士在读期间发表的文章目录 | 第67-68页 |
| 外文论文 | 第68-106页 |
| 第一篇 | 第68-90页 |
| 第二篇 | 第90-106页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第106页 |
