| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第1章 绪论 | 第13-25页 |
| 1.1 引言 | 第13页 |
| 1.2 线粒体与神经退化 | 第13-15页 |
| 1.3 线粒体DNA与神经退化 | 第15-18页 |
| 1.4 线粒体动态与CMT2A疾病 | 第18-21页 |
| 1.5 神经退化中内质网的重塑 | 第21页 |
| 1.6 神经退化诱导模型 | 第21-23页 |
| 1.7 iPSCs诱导和神经分化技术 | 第23-25页 |
| 第2章 实验方法与实验步骤 | 第25-46页 |
| 2.1 质粒构建 | 第25-26页 |
| 2.1.1 细胞器标记质粒的构建 | 第25页 |
| 2.1.2 内质网-线粒体接头载体的构建 | 第25页 |
| 2.1.3 运动神经元标记质粒 | 第25-26页 |
| 2.2 CMT2A,ADOA病人iPSCs的诱导 | 第26-34页 |
| 2.2.1 CMT2A病人皮肤细胞,ADOA病人尿液细胞的获得和培养 | 第26-27页 |
| 2.2.2 原代细胞的支原体检测与冻存 | 第27页 |
| 2.2.3 iPSCs诱导的相关准备工作 | 第27-28页 |
| 2.2.4 iPSCs的诱导 | 第28-31页 |
| 2.2.5 iPSCs克隆的挑取,培养与冻存 | 第31-32页 |
| 2.2.6 iPSCs细胞的鉴定 | 第32-34页 |
| 2.3 iPSCs的神经分化 | 第34-36页 |
| 2.3.1 人神经前体细胞与神经元的诱导 | 第34-35页 |
| 2.3.2 人神经元的随机分化 | 第35页 |
| 2.3.3 运动神经元分化 | 第35-36页 |
| 2.4 神经退化模型 | 第36-38页 |
| 2.4.1 体内神经退化模型(臂丛神经截断术) | 第36-37页 |
| 2.4.2 体外神经退化(激光突出切断) | 第37页 |
| 2.4.3 神经退化的检测 | 第37-38页 |
| 2.5 线粒体相关检测 | 第38-42页 |
| 2.5.1 神经元线粒体相关标记 | 第38页 |
| 2.5.2 线粒体长度的测量 | 第38-39页 |
| 2.5.3 线粒体电势的测量 | 第39页 |
| 2.5.4 线粒体Ca~(2+)浓度的测量 | 第39-40页 |
| 2.5.5 线粒体mPTP的测量 | 第40页 |
| 2.5.6 线粒体运动的测量 | 第40-41页 |
| 2.5.7 线粒体和内质网的三维重构 | 第41页 |
| 2.5.8 电镜检测 | 第41-42页 |
| 2.6 ROS检测 | 第42页 |
| 2.7 神经元代谢检测 | 第42-43页 |
| 2.7.1 胞内总ATP水平的检测 | 第42页 |
| 2.7.2 seahorse的检测 | 第42-43页 |
| 2.8 神经元膜片钳检测 | 第43-44页 |
| 2.9 动物行为学实验 | 第44-46页 |
| 2.9.1 转棒实验: | 第44页 |
| 2.9.2 水迷宫实验: | 第44-45页 |
| 2.9.3 旷场实验: | 第45页 |
| 2.9.4 悬尾实验: | 第45-46页 |
| 第3章 实验结果与实验数据 | 第46-113页 |
| 3.1 MFN2R94Q和ADOAiPSCs诱导和功能检测 | 第46-56页 |
| 3.1.1 CMT2A病人皮肤成纤维细胞和ADOA病人尿液细胞可以诱导成为诱导多能干细胞 | 第46-48页 |
| 3.1.2 MFN2R94Q iPSCs具有多能性 | 第48-50页 |
| 3.1.3 MFN2R94Q iPSCs线粒体功能的检测 | 第50-55页 |
| 3.1.4 MFN2R94Q iPSCs具有正常ROS水平和细胞周期 | 第55-56页 |
| 3.2 MFN2R94Q iPSCs来源的神经元中出现内质网和线粒体的偶联 | 第56-71页 |
| 3.2.1 MFN2R94Q iPSCs可以分化成为神经干细胞 | 第56-58页 |
| 3.2.2 MFN2R94Q神经干细胞中MFN1,OPA1表达水平下降,ROS水平增加 | 第58-61页 |
| 3.2.3 MFN2R94Q神经干细胞可以分化成为多种神经元和胶质细胞 | 第61-63页 |
| 3.2.4 MFN2R94Q神经元线粒体相关功能的检测 | 第63-67页 |
| 3.2.5 MFN2R94Q神经元胞体ROS水平异常升高 | 第67页 |
| 3.2.6 MFN2R94Q神经元中片段化内质网和线粒体的关系 | 第67-69页 |
| 3.2.7 MFN2R94Q神经元出现突出退化 | 第69-71页 |
| 3.3 体外突出切断或polybrene诱导神经退化模型中出现内质网-线粒体复合体 | 第71-81页 |
| 3.3.1 突出切断或polybrene诱导神经退化中出现线粒体-内质网复合体 | 第71-74页 |
| 3.3.2 退化的神经元中内质网-线粒体复合体 | 第74-76页 |
| 3.3.3 内质网-线粒体复合体也出现在体内神经退化模型中 | 第76-77页 |
| 3.3.4 退化神经元中线粒体功能异常 | 第77-80页 |
| 3.3.5 polybrene诱导神经元中胞体ROS水平升高 | 第80-81页 |
| 3.4 神经退化和内质网片段化具有线粒体电势依赖性 | 第81-84页 |
| 3.4.1 降低线粒体的电势能抑制突出切断或polybrene诱导的线粒体Ca~(2+)浓度的异常升高 | 第81-82页 |
| 3.4.2 降低线粒体的电势能抑制突出切断或polybrene诱导的神经退化现象 | 第82-83页 |
| 3.4.3 降低线粒体的电势能抑制突出切断或polybrene诱导的突出内质网的片段化 | 第83-84页 |
| 3.5 利用人工内质网-线粒体接头研究内质网-线粒体复合体在神经退化中的作用 | 第84-93页 |
| 3.5.1 OMM-ER接头能改变内质网的形态,模拟内质网和线粒体复合体 | 第84-86页 |
| 3.5.2 表达OMM-FP-ER接头蛋白的同时促进内质网Ca~(2+)释放能导致神经突出退化的发生 | 第86-88页 |
| 3.5.3 表达OMM-ER接头蛋白的同时促进内质网Ca~(2+)释放导致线粒体功能异常 | 第88-92页 |
| 3.5.4 表达OMM-ER接头蛋白的同时促进内质网Ca~(2+)释放导致神经元ROS水平的增加 | 第92-93页 |
| 3.6 体外研究线粒体DNA在神经元中的作用 | 第93-109页 |
| 3.6.1 表达UL12.5可以降解神经元细胞mtDNA | 第94-96页 |
| 3.6.2 mtDNA对神经元基因转录水平的影响 | 第96-97页 |
| 3.6.3 mtDNA对胞质Ca~(2+)浓度的影响 | 第97页 |
| 3.6.4 mtDNA对神经元线粒体功能的影响 | 第97-104页 |
| 3.6.5 mtDNA对神经元代谢的影响 | 第104-106页 |
| 3.6.6 mtDNA对神经元电生理的影响 | 第106-107页 |
| 3.6.7 卡路里限制导致mtDNA缺失神经元退化和凋亡 | 第107-109页 |
| 3.7 体内研究卡路里限制对mtDNA突变小鼠的影响 | 第109-113页 |
| 3.7.1 卡路里限制对POLG突变小鼠运动耐受的影响 | 第109-110页 |
| 3.7.2 卡路里限制对POLG突变小鼠学习记忆的影响 | 第110-111页 |
| 3.7.3 卡路里限制对POLG突变小鼠焦虑和抑郁的影响 | 第111-113页 |
| 第4章 讨论 | 第113-117页 |
| 参考文献 | 第117-132页 |
| 附录一 实验材料与试剂 | 第132-134页 |
| 附录二 试验中所用到的各种培养基的配方 | 第134-135页 |
| 附录三 实验中使用的引物序列与抗体 | 第135-138页 |
| 致谢 | 第138-139页 |
| 在读期间取得的科研成果 | 第139页 |
