| 致谢 | 第4-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| SUMMARY | 第8-9页 |
| 一、引言 | 第15-28页 |
| 1.1 黏膜免疫与黏膜疫苗 | 第15-16页 |
| 1.2 黏膜佐剂及相关机制 | 第16-19页 |
| 1.2.1 抗原提呈系统 | 第16-17页 |
| 1.2.2 细胞因子 | 第17-18页 |
| 1.2.3 微生物成分 | 第18-19页 |
| 1.3 黏膜IgA在抗感染中的重要作用 | 第19-20页 |
| 1.4 重组鞭毛素蛋白作为鼻腔黏膜佐剂在疫苗中的应用 | 第20-21页 |
| 1.5 重组鞭毛素蛋白的佐剂效应机制 | 第21-24页 |
| 1.6 树突状细胞在介导IgA应答中的作用 | 第24-25页 |
| 1.7 黏膜上皮细胞在介导IgA应答中的作用 | 第25-27页 |
| 1.8 本课题的研究目的及实验设计 | 第27-28页 |
| 二、材料与方法 | 第28-50页 |
| 2.1 实验仪器、试剂和耗材 | 第28-34页 |
| 2.1.1 实验仪器 | 第28页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第28-31页 |
| 2.1.3 耗材 | 第31页 |
| 2.1.4 生物材料 | 第31页 |
| 2.1.5 培养基、缓冲液及溶液配方 | 第31-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-50页 |
| 2.2.1 Flagellin-EGFP融合蛋白质粒构建 | 第34页 |
| 2.2.2 重组蛋白的表达、纯化及检测 | 第34-36页 |
| 2.2.3 TritonX-114 法去除蛋白内毒素 | 第36页 |
| 2.2.4 小鼠滴鼻免疫实验 | 第36页 |
| 2.2.5 小鼠免疫后样品采集 | 第36-37页 |
| 2.2.6 ELISA检测小鼠血清及黏膜样中抗体滴度 | 第37页 |
| 2.2.7 FACS用鼻腔局部总淋巴细胞分离 | 第37-38页 |
| 2.2.8 FACS用呼吸道局部淋巴结总淋巴细胞分离 | 第38页 |
| 2.2.9 FACS用肺组织总淋巴细胞分离 | 第38-39页 |
| 2.2.10 16% Histodenz富集DC | 第39页 |
| 2.2.11 流式细胞术检测DC表面CD80/86 表达 | 第39-40页 |
| 2.2.12 流式细胞术检测DC摄取荧光抗原 | 第40页 |
| 2.2.13 免疫组化实验 | 第40-42页 |
| 2.2.14 小鼠原代鼻腔上皮细胞的分离与体外培养 | 第42-43页 |
| 2.2.15 免疫荧光染色及共聚焦观察 | 第43页 |
| 2.2.16 原代鼻腔上皮(NEC)细胞刺激和上清收集 | 第43-44页 |
| 2.2.17 分离颈部引流淋巴结DC及体外刺激 | 第44-45页 |
| 2.2.18 脾脏na?ve B细胞的分选 | 第45-46页 |
| 2.2.19 DC与na?ve B细胞共培养 | 第46页 |
| 2.2.20 ELISA检测共培养体系中总IgA/IgG | 第46-47页 |
| 2.2.21 流式细胞术检测IgA+/IgG+ B细胞 | 第47-48页 |
| 2.2.22 细胞因子及细胞因子芯片检测 | 第48页 |
| 2.2.23 细胞因子体外中和实验 | 第48页 |
| 2.2.24 小鼠体内GM-CSF中和实验 | 第48-49页 |
| 2.2.25 实验统计学分析 | 第49-50页 |
| 三、实验结果 | 第50-86页 |
| 3.1 重组鞭毛素蛋白flagellin鼻腔免疫的黏膜佐剂效应 | 第50-51页 |
| 第一部分 flagellin在小鼠鼻腔黏膜局部的摄入和分布特征 | 第51-58页 |
| 3.2 鼠鼻腔黏膜上皮TLR5的表达及分布 | 第52-53页 |
| 3.3 鼻腔黏膜上皮细胞以非TLR5依赖的方式摄取Flagellin | 第53-55页 |
| 3.3.1 Flagellin在鼻腔黏膜上皮层的分布 | 第53-54页 |
| 3.3.2 鼻腔黏膜上皮细胞摄入Flagellin的方式为非TLR5依赖 | 第54-55页 |
| 3.4 Flagellin能被鼻腔黏膜局部DC(nasal DC)快速有效摄取 | 第55-57页 |
| 3.4.1 构建并表达flagellin-EGFP融合蛋白 | 第55-56页 |
| 3.4.2 Nasal DC可有效摄取flagellin-EGFP | 第56-57页 |
| 3.5 小结flagellin滴鼻后在鼻腔局部的摄入特征 | 第57-58页 |
| 第二部分：flagellin作为鼻腔黏膜佐剂对呼吸道DC的作用 | 第58-66页 |
| 3.6 Flagellin不能促进nasal DC摄取免疫抗原 | 第58-59页 |
| 3.7 Flagellin以TLR5依赖的方式促进nasal DC迁移至CLN | 第59-61页 |
| 3.8 Flagellin以TLR5依赖的方式活化呼吸道DC | 第61-64页 |
| 3.8.1 Flagellin滴鼻免疫以TLR5依赖的方式促进CLN DC活化 | 第61-62页 |
| 3.8.2 Flagellin活化呼吸道DC的时空特征 | 第62-64页 |
| 3.9 Flagellin以TLR5依赖的方式促进DC介导的IgA-CSR | 第64-65页 |
| 3.10 小结flagellin作为鼻腔黏膜佐剂调节呼吸道DC的具体方式 | 第65-66页 |
| 第三部分：Flagellin活化呼吸道DC及增强黏膜特异IgA应答的分子机制 | 第66-86页 |
| 3.11 Flagellin不能直接有效活化DC及促进IgA应答 | 第66-70页 |
| 3.11.1 Flagellin直接刺激对CLN DC的活化检测 | 第66-67页 |
| 3.11.2 Flagellin直接刺激对DC介导IgA应答能力的检测 | 第67-70页 |
| 3.12 Flagellin通过活化mNEC的TLR5通路从而间接活化DC及促进IgA应答 | 第70-75页 |
| 3.12.1 鼠原代鼻腔上皮细胞(mNEC)的体外培养模型 | 第70-71页 |
| 3.12.2 flagellin刺激mNEC的细胞上清制备 | 第71-72页 |
| 3.12.3 mNEC细胞上清对CLN DC的活化检测 | 第72-73页 |
| 3.12.4 mNEC细胞上清对DC介导IgA应答能力的检测 | 第73-75页 |
| 3.13 GM-CSF是TLR5激活的mNEC间接活化DC的关键因子 | 第75-81页 |
| 3.13.1 TLR5激活的mNEC分泌的细胞因子谱 | 第75-76页 |
| 3.13.2 ELISA定量检测TLR5激活的mNEC分泌的细胞因子 | 第76-77页 |
| 3.13.3 GM-CSF是TLR5激活的mNEC间接活化DC的关键因子 | 第77-78页 |
| 3.13.4 GM-CSF是DC诱导IgA应答的关键因子 | 第78-81页 |
| 3.14 GM-CSF对flagellin作为鼻腔黏膜佐剂所诱导的免疫应答起重要作用 | 第81-86页 |
| 3.14.1 小鼠体内中和GM-CSF削弱flagellin诱导的nasal DC活化 | 第81-82页 |
| 3.14.2 小鼠体内中和GM-CSF削弱flagellin诱导的CLN DC活化 | 第82-83页 |
| 3.14.3 小鼠体内中和GM-CSF削弱flagellin诱导的特异性IgA应答 | 第83-86页 |
| 四、总结 | 第86-87页 |
| 五、讨论 | 第87-96页 |
| 5.1 鼻腔的生理特点和吸收机制 | 第87-88页 |
| 5.2 滴鼻免疫方式 | 第88-90页 |
| 5.3 呼吸道上皮细胞与肠道上皮TLRs通路激活比较 | 第90-91页 |
| 5.4 GM-CSF在介导免疫应答方面的作用 | 第91-92页 |
| 5.5 鞭毛素蛋白滴鼻免疫作用的DC亚类 | 第92-94页 |
| 5.6 鼻腔TLR5通路激活诱导IgA应答 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-105页 |
| 作者简历 | 第105-106页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第106-107页 |
