| 中文摘要 | 第7-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一部分 Rv2837c的结构与功能研究 | 第15-57页 |
| 第一章 前言 | 第15-23页 |
| 1.1 环二核苷酸内容相关介绍 | 第15-19页 |
| 1.2 Rv2837c蛋白的相关介绍 | 第19-20页 |
| 1.3 本课题研究内容及结果 | 第20-23页 |
| 第二章 Rv2837c蛋白纯化、结晶、结构解析及功能研究 | 第23-41页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-24页 |
| 2.2.1 菌株及载体 | 第23页 |
| 2.2.2 试剂及工具酶 | 第23-24页 |
| 2.2.3 主要仪器及服务 | 第24页 |
| 2.3 实验设计及具体的实验步骤 | 第24-29页 |
| 2.3.1 蛋白晶体的获得及结构解析 | 第24-28页 |
| 2.3.2 结构分析及酶活测定 | 第28-29页 |
| 2.4 实验结果及分析 | 第29-35页 |
| 2.4.1 Rv2837c蛋白及硒代蛋白的纯化、结晶 | 第29-31页 |
| 2.4.2 Rv2837c蛋白是能降解c-di-AMP的磷酸二酯酶 | 第31-33页 |
| 2.4.3 蛋白的数据收集及结构解析 | 第33-35页 |
| 2.5 实验分析及讨论 | 第35-40页 |
| 2.5.1 Rv2837c蛋白整体结构描述及分析 | 第35-36页 |
| 2.5.2 Rv2837c晶体结构活性位点处有两个锰离子 | 第36-37页 |
| 2.5.3 Rv2837c/5'-pApA复合物结构分析 | 第37-38页 |
| 2.5.4 Rv2837c /c-di-AMP分子对接结果分析 | 第38-40页 |
| 2.6 本章小结 | 第40-41页 |
| 第三章 Rv2837c蛋白的功能研究 | 第41-57页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 实验材料及仪器 | 第41页 |
| 3.3 实验设计和方法 | 第41-44页 |
| 3.3.1 突变体的选择和构建 | 第41-43页 |
| 3.3.2 圆二色谱测定突变体蛋白的性质 | 第43页 |
| 3.3.3 HPLC方法测定酶活及cGAMP产物鉴定 | 第43页 |
| 3.3.4 耻垢分枝杆菌胞内环二核苷酸水平鉴定 | 第43-44页 |
| 3.3.5 测细菌移动性及鉴定胞内c-di-GMP水平 | 第44页 |
| 3.3.6 c-di-AMP晶体的生长及结构解析 | 第44页 |
| 3.4 实验结果 | 第44-50页 |
| 3.4.1 Rv2837c酶活反应需要两个锰离子 | 第44-45页 |
| 3.4.2 Rv2837c作为PDE酶活降解分子机制 | 第45-47页 |
| 3.4.3 Rv2837c特异性识别降解3'-5'磷酸二酯键 | 第47-49页 |
| 3.4.4 Rv2837c在体内降解c-di-AMP和c-di-GMP | 第49-50页 |
| 3.5 实验分析及讨论 | 第50-55页 |
| 3.5.1 Rv2837c降解c-di-NMPs可能采用翻转降解机制 | 第50-53页 |
| 3.5.2 底物c-di-NMPs的聚集状态影响Rv2837c酶活速率 | 第53-55页 |
| 3.6 本章小结 | 第55-57页 |
| 第二部分 转录调节因子BrlR的结构及功能研究 | 第57-119页 |
| 第一章 前言 | 第57-71页 |
| 1.1 铜绿耐药性相关介绍 | 第57-62页 |
| 1.1.1 铜绿假单胞菌概述 | 第57页 |
| 1.1.2 铜绿假单胞菌生物被膜简介 | 第57-60页 |
| 1.1.3 外排泵与MerR家族蛋白介绍 | 第60-62页 |
| 1.2 c-di-GMP简介 | 第62-64页 |
| 1.3 毒力因子绿脓菌素的概述 | 第64-67页 |
| 1.3.1 铜绿假单胞菌群体感应效应 | 第65-66页 |
| 1.3.2 绿脓菌素的合成、调控及致病性 | 第66-67页 |
| 1.4 BrlR蛋白的研究进展 | 第67-71页 |
| 1.4.1 BrlR蛋白与铜绿生物被膜耐药性相关 | 第67-68页 |
| 1.4.2 BrlR蛋白与c-di-GMP | 第68-71页 |
| 第二章 BrlR,BrlR/c-di-GMP复合物的表达纯化结晶及结构解析 | 第71-87页 |
| 2.1 引言 | 第71页 |
| 2.2 实验材料 | 第71-72页 |
| 2.2.1 菌株及载体 | 第71-72页 |
| 2.2.2 主要仪器及试剂 | 第72页 |
| 2.3 实验方法 | 第72-75页 |
| 2.3.1 构建原核表达质粒 | 第72-74页 |
| 2.3.2 BrlR蛋白及硒代标记蛋白的表达纯化 | 第74页 |
| 2.3.3 BrlR与c-di-GMP复合物的制备 | 第74页 |
| 2.3.4 蛋白质晶体的培养及初步衍射分析 | 第74-75页 |
| 2.3.5 数据收集及结构解析 | 第75页 |
| 2.4 实验结果 | 第75-82页 |
| 2.4.1 BrlR蛋白的纯化,结晶以及初步衍射结果 | 第75-77页 |
| 2.4.2 BrlR与c-di-GMP复合物的制备,结晶以及初步衍射结果 | 第77页 |
| 2.4.3 BrlR/c-di-GMP复合物及BrlR结构的解析及修正结果 | 第77-79页 |
| 2.4.4 BrlR与BrlR/c-di-GMP复合物整体结构分析与比较 | 第79-82页 |
| 2.5 实验分析与讨论 | 第82-86页 |
| 2.5.1 BrlR与其它MerR家族结构的比较分析 | 第82-84页 |
| 2.5.2 BrlR的HTH结构域有两个明显的c-di-GMP结合位点 | 第84-86页 |
| 2.6 本章小结 | 第86-87页 |
| 第三章 c-di-GMP与BrlR蛋白的相互作用研究 | 第87-107页 |
| 3.1 引言 | 第87-88页 |
| 3.2 实验材料及仪器 | 第88页 |
| 3.2.1 菌株及载体 | 第88页 |
| 3.2.2 试剂及仪器 | 第88页 |
| 3.3 实验目的及实验方法 | 第88-95页 |
| 3.3.1 BrlR蛋白在溶液中聚集状态的鉴定 | 第88-89页 |
| 3.3.2 BrlR蛋白与DNA相互作用初步研究 | 第89-91页 |
| 3.3.3 c-di-GMP与BrlR蛋白的相互作用验证 | 第91-93页 |
| 3.3.4 c-di-GMP对蛋白结合DNA的作用影响研究 | 第93-95页 |
| 3.4 实验结果 | 第95-105页 |
| 3.4.1 BrlR蛋白在溶液中为四聚体 | 第95-96页 |
| 3.4.2 BrlR蛋白与DNA的结合分析 | 第96-97页 |
| 3.4.3 BrlR具有两个结合c-di-GMP的位点 | 第97-101页 |
| 3.4.4 c-di-GMP可以改变BrlR的构象 | 第101-103页 |
| 3.4.5 两个位点的c-di-GMP都能增强BrlR-DNA的结合 | 第103-105页 |
| 3.5 本章小结 | 第105-107页 |
| 第四章 BrlR多药物结合位点的鉴定以及功能研究 | 第107-119页 |
| 4.1 引言 | 第107页 |
| 4.2 实验材料和仪器 | 第107页 |
| 4.3 实验目的和具体实验方法 | 第107-109页 |
| 4.3.1 SPR实验确定不同药物分子对BrlR的结合力 | 第108页 |
| 4.3.2 BrlR-C与PYO类似物复合物晶体筛选及结构解析 | 第108页 |
| 4.3.3 RT-PCR实验确定BrlR为绿脓菌素受体蛋白 | 第108-109页 |
| 4.4 实验结果 | 第109-118页 |
| 4.4.1 BrlR是多药物结合蛋白可以结合多种药物分子 | 第109-113页 |
| 4.4.2 BrlR-C/pyocyanin-analog复合物纯化、结晶及结构解析 | 第113页 |
| 4.4.3 BrlR-C/pyocyanin-analog复合物晶体结构分析比较 | 第113-115页 |
| 4.4.4 BrlR是受绿脓菌素调控的转录调节因子 | 第115-118页 |
| 4.5 本章小结 | 第118-119页 |
| 全文总结 | 第119-121页 |
| 参考文献 | 第121-131页 |
| 致谢 | 第131-133页 |
| 博士期间发表的学术论文 | 第133-134页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第134页 |
