| 内容提要 | 第1-5页 |
| 英文缩略词表 | 第5-7页 |
| 中文摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-20页 |
| 第1章 绪论 | 第20-40页 |
| ·合成生物学简介 | 第20-21页 |
| ·合成生物学的国内外研究进展 | 第21-24页 |
| ·国外研究进展 | 第21-23页 |
| ·国内研究现况 | 第23-24页 |
| ·合成生物学应用的关键技术及问题 | 第24-30页 |
| ·基因组的人工合成技术 | 第24-29页 |
| ·最小基因组技术 | 第29-30页 |
| ·合成生物学在天然产物类药物中的应用 | 第30-32页 |
| ·天然产物的生物合成基因簇的异源表达 | 第30-31页 |
| ·对已有的天然产物的生物合成途径进行优化改造 | 第31页 |
| ·设计、人工合成目标化学物的生物合成基因簇进行异源表达 | 第31-32页 |
| ·达托霉素的研究进展 | 第32-37页 |
| ·达托霉素概述 | 第32页 |
| ·达托霉素的抗菌活性 | 第32-33页 |
| ·达托霉素的作用机制 | 第33-34页 |
| ·达托霉素的应用前景 | 第34-35页 |
| ·达托霉素的合成 | 第35-37页 |
| ·本论文选题的目的与意义 | 第37-40页 |
| 第2章 达托霉素生物合成基因簇的设计、合成和扩增 | 第40-58页 |
| ·实验材料 | 第40-42页 |
| ·菌株和质粒 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40页 |
| ·主要培养基和溶液的配制 | 第40-41页 |
| ·主要仪器 | 第41-42页 |
| ·实验方法 | 第42-48页 |
| ·达托霉素生物合成基因的设计 | 第42页 |
| ·达托霉素生物合成基因簇片段的合成 | 第42-43页 |
| ·达托霉素生物合成基因簇片段的 PCR 扩增 | 第43-48页 |
| ·实验结果与讨论 | 第48-55页 |
| ·达托霉素第 11-30kb 基因簇的合成 | 第48-49页 |
| ·链霉菌的培养以及基因组的提取 | 第49-50页 |
| ·基因簇片段 PCR 扩增的优化 | 第50-55页 |
| ·本章小结 | 第55-58页 |
| 第3章 体外重组系统-Gibson 等温一步拼接方法的建立 | 第58-72页 |
| ·实验材料 | 第58-60页 |
| ·菌株和质粒 | 第58页 |
| ·主要试剂 | 第58-59页 |
| ·主要培养基和溶液的配制 | 第59页 |
| ·主要仪器 | 第59-60页 |
| ·实验方法 | 第60-64页 |
| ·待连接 DNA 片段的制备 | 第60-61页 |
| ·载体的设计制备 | 第61-63页 |
| ·Gibson 等温一步法连接反应体系 | 第63页 |
| ·Gibson 等温一步法连接产物的扩增 | 第63-64页 |
| ·Gibson 等温一步法连接产物分析 | 第64页 |
| ·实验结果与讨论 | 第64-71页 |
| ·体外重组系统--Gibson 等温一步法 | 第64页 |
| ·待连接 DNA 片段的制备 | 第64-65页 |
| ·拼接载体的构建 | 第65-66页 |
| ·5 kb DNA 片段的拼接 | 第66-68页 |
| ·连接产物的鉴定 | 第68-70页 |
| ·连接反应体系的改进 | 第70页 |
| ·2 kb 的拼接 | 第70-71页 |
| ·本章小结 | 第71-72页 |
| 第4章 酵母体内同源重组拼接方法的建立 | 第72-88页 |
| ·实验材料 | 第72-74页 |
| ·菌株和质粒 | 第72页 |
| ·主要试剂 | 第72-73页 |
| ·主要培养基和溶液的配制 | 第73页 |
| ·主要仪器 | 第73-74页 |
| ·实验方法 | 第74-81页 |
| ·待连接 DNA 片段制备 | 第74页 |
| ·载体的设计制备 | 第74-76页 |
| ·酵母转化 | 第76-77页 |
| ·拼接产物菌落 PCR 鉴定 | 第77-78页 |
| ·酵母质粒提取 | 第78-79页 |
| ·酵母质粒电转大肠杆菌 DH10B | 第79-80页 |
| ·测序分析连接产物 | 第80页 |
| ·20 kb 长片段 DNA 的拼接 | 第80-81页 |
| ·实验结果与讨论 | 第81-86页 |
| ·待连接 DNA 片段的制备 | 第81-82页 |
| ·载体的构建 | 第82页 |
| ·酵母体内重组连接 | 第82-83页 |
| ·鉴定方法的确定 | 第83-84页 |
| ·酵母质粒的提取 | 第84页 |
| ·连接产物测序分析 | 第84-85页 |
| ·20 kb 长片段的拼接 | 第85-86页 |
| ·本章小结 | 第86-88页 |
| 第5章 达托霉素生物合成基因簇的拼接 | 第88-102页 |
| ·实验材料 | 第88-89页 |
| ·菌株和质粒 | 第88页 |
| ·主要试剂 | 第88-89页 |
| ·主要培养基和溶液的配制 | 第89页 |
| ·主要仪器 | 第89页 |
| ·实验方法 | 第89-96页 |
| ·实验设计 | 第89页 |
| ·10 kb 长片段的拼接 | 第89-92页 |
| ·128 kb 生物合成基因簇的拼接 | 第92-96页 |
| ·实验结果与讨论 | 第96-99页 |
| ·10 kb 中间体的拼接 | 第96页 |
| ·128 kb 生物合成基因簇的拼接 | 第96-99页 |
| ·本章小结 | 第99-102页 |
| 第6章 大肠杆菌-链霉菌穿梭型表达 BAC 载体的构建 | 第102-116页 |
| ·实验材料 | 第103-105页 |
| ·菌株和质粒 | 第103页 |
| ·主要试剂 | 第103页 |
| ·主要培养基和溶液的配制 | 第103-104页 |
| ·主要仪器 | 第104-105页 |
| ·实验方法 | 第105-109页 |
| ·设计思路 | 第105页 |
| ·扩增替换盒 | 第105-106页 |
| ·E.coli K-12/pBeloBAC11/pKD46 的构建 | 第106-107页 |
| ·替换盒电转至 E.coli K-12/pBeloBAC11/pKD46 进行重组 | 第107页 |
| ·pBTIBAC1 载体功能的验证 | 第107-109页 |
| ·pBTIBAC1 载体插入多克隆位点 MCS | 第109页 |
| ·实验结果与讨论 | 第109-113页 |
| ·pBTIBAC1 的构建 | 第109页 |
| ·替换盒的扩增 | 第109-111页 |
| ·Red 同源重组及转化子的鉴定 | 第111-112页 |
| ·pBTIBAC1 载体功能的验证 | 第112-113页 |
| ·多克隆位点(MCS)的构建 | 第113页 |
| ·本章小结 | 第113-116页 |
| 第7章 达托霉素的异源表达 | 第116-128页 |
| ·实验材料 | 第116-118页 |
| ·菌株和质粒 | 第116页 |
| ·主要试剂 | 第116页 |
| ·主要培养基和溶液的配制 | 第116-117页 |
| ·主要仪器 | 第117-118页 |
| ·实验方法 | 第118-121页 |
| ·pYES1-DAP128 和 pBTIBAC11 质粒的提取 | 第118页 |
| ·pYES1-DAP128 质粒酶切，回收大片段 | 第118页 |
| ·pBTIBAC11 载体用 PmeⅠ酶切 | 第118页 |
| ·DAP128 与 pBTIBAC11 载体连接 | 第118-119页 |
| ·pBTIBAC11-DPT128 电转化大肠杆菌 DH10B | 第119页 |
| ·pBTIBAC11-DPT128 导入变铅青链霉菌 TK24 中 | 第119-120页 |
| ·变铅青链霉菌 TK24 的发酵培养 | 第120页 |
| ·检测发酵液中达托霉素的表达 | 第120-121页 |
| ·达托霉素的生物活性测定 | 第121页 |
| ·结果与讨论 | 第121-126页 |
| ·128kb 的达托霉素大片段的回收 | 第121页 |
| ·128kb 的达托霉素大片段与载体的连接 | 第121-122页 |
| ·pBTIBAC11-DPT128 电转化大肠杆菌 DH10B | 第122页 |
| ·阳性转化子的鉴定 | 第122-123页 |
| ·结合转移 | 第123页 |
| ·HPLC 法检测发酵液中达托霉素的表达 | 第123-124页 |
| ·达托霉素生物活性验证 | 第124-126页 |
| ·本章小结 | 第126-128页 |
| 第8章 达托霉素治疗炭疽作用机制的初步研究 | 第128-142页 |
| ·实验材料 | 第129-130页 |
| ·菌株和细胞株 | 第129页 |
| ·主要试剂 | 第129页 |
| ·主要培养基和溶液的配制 | 第129-130页 |
| ·主要仪器 | 第130页 |
| ·实验方法 | 第130-133页 |
| ·达托霉素及其它抗生素 MIC 值的测定 | 第130-131页 |
| ·达托霉素的时间杀伤曲线(Time-Kill curves) | 第131页 |
| ·达托霉素对 B.anthracis AP422 芽孢的作用 | 第131页 |
| ·达托霉素对 B.anthracis AP422 膜电位的影响 | 第131-132页 |
| ·达托霉素对 B.anthracis AP422 膜完整性的影响 | 第132页 |
| ·达托霉素对钾离子释放的影响 | 第132页 |
| ·达托霉素体外巨噬细胞保护实验 | 第132-133页 |
| ·实验结果及讨论 | 第133-140页 |
| ·抗生素 MIC 值测定 | 第133页 |
| ·达托霉素对 B.anthracis AP422 的时间杀伤曲线 | 第133-134页 |
| ·达托霉素对 B.anthracis AP422 芽孢的影响 | 第134-135页 |
| ·达托霉素能降低 B.anthracis AP422 细胞膜电位 | 第135-137页 |
| ·达托霉素不破坏细胞膜的完整性 | 第137-139页 |
| ·达托霉素促进细胞钾离子的释放 | 第139页 |
| ·达托霉素体外巨噬细胞保护实验 | 第139-140页 |
| ·本章小结 | 第140-142页 |
| 结论 | 第142-143页 |
| 参考文献 | 第143-153页 |
| 作者简介 | 第153-154页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第154-155页 |
| 致谢 | 第155-157页 |
| 附录 | 第157-162页 |
