| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-11页 |
| 第一章 综述 | 第11-31页 |
| 1. 苹果酸脱氢酶概述 | 第11页 |
| 2. 苹果酸脱氢酶的分类 | 第11页 |
| 3. 苹果酸脱氢酶的结构与催化机制 | 第11-13页 |
| ·MDH 的结构 | 第11-13页 |
| ·MDH 的催化调节机制 | 第13页 |
| 4. 苹果酸脱氢酶的进化与内共生假说 | 第13-20页 |
| ·MDH 的进化 | 第13-16页 |
| ·MDH 进化与内共生假说 | 第16-20页 |
| 5. 苹果酸脱氢酶的辅酶特异性 | 第20-21页 |
| 6. 苹果酸脱氢酶参与乙酸代谢的功能研究 | 第21-22页 |
| 7. 实验意义及展望 | 第22-23页 |
| 参考文献 | 第23-31页 |
| 第二章 大肠杆菌苹果酸脱氢酶辅酶特异性改造 | 第31-57页 |
| 1 材料与方法 | 第32-43页 |
| ·材料 | 第32-35页 |
| ·菌株和质粒 | 第32-33页 |
| ·酶及试剂盒 | 第33页 |
| ·培养基及试剂 | 第33-35页 |
| ·实验方法与步骤 | 第35-43页 |
| ·生物信息学分析与突变位点的选择 | 第35页 |
| ·突变型重组质粒的构建 | 第35-40页 |
| ·突变型 MDH 蛋白的表达与纯化 | 第40-42页 |
| ·野生型和突变体 MDH 蛋白的酶学研究 | 第42-43页 |
| 2. 结果与分析 | 第43-49页 |
| ·辅酶特异性突变位点的选择 | 第43页 |
| ·突变型重组质粒的构建 | 第43-45页 |
| ·突变型 mdh 基因的扩增 | 第43-44页 |
| ·突变型 mdh 基因与载体的酶切、连接和转化 | 第44页 |
| ·重组质粒的抽提鉴定 | 第44-45页 |
| ·突变型 mdh 基因的测序鉴定 | 第45页 |
| ·野生型和突变体蛋白的表达与纯化 | 第45-46页 |
| ·野生型酶和突变体酶的活性检测 | 第46-47页 |
| ·野生型酶和突变体酶的动力学参数 | 第47-49页 |
| ·野生型酶 EcMDH 的动力学参数 | 第48页 |
| ·突变体酶 G~(34)S~(35)S~(36)G~(77)的动力学参数 | 第48页 |
| ·突变体酶 G~(34)S~(35)S~(36)G~(77)A~(79)的动力学参数 | 第48页 |
| ·突变体酶 G~(34)S~(35)S~(36)G~(77)G~(79)的动力学参数 | 第48-49页 |
| 3. 讨论 | 第49-54页 |
| ·决定辅酶特异性的关键氨基酸位点 | 第49-50页 |
| ·突变体酶的辅酶特异性 | 第50-52页 |
| ·脱氢酶辅酶特异性改造的意义 | 第52-54页 |
| 参考文献 | 第54-57页 |
| 第三章 大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因的敲除和敲入及其生理功能的研究 | 第57-75页 |
| 1 材料与方法 | 第59-66页 |
| ·材料 | 第59-62页 |
| ·菌株和质粒 | 第59页 |
| ·酶及试剂盒 | 第59页 |
| ·培养基及试剂 | 第59-62页 |
| ·实验方法 | 第62-66页 |
| ·同源重组技术 | 第62页 |
| ·Wt/mdh 和 Ym/mdh 菌株的构建 | 第62-66页 |
| ·不同碳源条件下 Wt、Ym、Wt/mdh、Ym/mdh 生长速率测定 | 第66页 |
| 2. 结果与分析 | 第66-70页 |
| ·用于基因敲除的同源重组片段扩增 | 第66-67页 |
| ·用于基因敲入的同源重组片段扩增 | 第67页 |
| ·PCR 鉴定 NAD-MDH 基因的敲除 | 第67-68页 |
| ·PCR 鉴定 NADP-MDH 基因的敲入 | 第68-69页 |
| ·测序鉴定 NADP-MDH 敲入位置无误 | 第69页 |
| ·生长曲线测定 | 第69-70页 |
| ·葡萄糖-MOPS 培养基上生曲线的测定 | 第69页 |
| ·乙酸-MOPS 培养基上生长曲线的测定 | 第69-70页 |
| 3. 讨论 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 附：本人在读研期间合作发表的科研论文、获奖及参与课题基金情况 | 第76页 |
