| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 引言 | 第8-14页 |
| 第一部分 类人弹性蛋白(HELP)基因表达条件的优化 | 第14-34页 |
| 第一节 材料和方法 | 第14-25页 |
| 1 材料 | 第14-19页 |
| ·器材和设备 | 第14-15页 |
| ·主要试剂和溶液 | 第15-19页 |
| 2 方法 | 第19-25页 |
| ·质粒筛选 | 第19-21页 |
| ·碱裂解法提取质粒 | 第19-20页 |
| ·限制性内切酶酶切鉴定和测序分析 | 第20页 |
| ·保存菌种 | 第20-21页 |
| ·转化表达宿主菌BL21(DE3) | 第21-22页 |
| ·CaCl_2法制备BL21(DE3)感受态细胞 | 第21页 |
| ·转化 | 第21-22页 |
| ·预表达 | 第22页 |
| ·采用正交试验设计优化表达条件 | 第22-23页 |
| ·5L发酵罐发酵 | 第23-24页 |
| ·目的蛋白质可溶性分析 | 第24-25页 |
| 第二节 实验结果 | 第25-28页 |
| 1 质粒筛选鉴定 | 第25页 |
| 2 预表达 | 第25-26页 |
| 3 正交实验设计最优表达 | 第26-27页 |
| 4 SDS-PAGE分析5L发酵罐表达量 | 第27页 |
| 5 可溶性分析 | 第27-28页 |
| 第三节 分析与讨论 | 第28-33页 |
| 1 质粒筛选及序列分析 | 第28-29页 |
| 2 表达结果分析 | 第29页 |
| 3 正交试验设计结果分析 | 第29-33页 |
| 4 可溶性分析 | 第33页 |
| 第四节 总结 | 第33-34页 |
| 第二部分 类人弹性蛋白(HELP)基因表达产物的纯化 | 第34-53页 |
| 第一节 材料和方法 | 第34-45页 |
| 1 材料 | 第34-39页 |
| ·器材和设备 | 第34-35页 |
| ·主要试剂和溶液 | 第35-39页 |
| 2 方法 | 第39-45页 |
| ·ITC循环纯化ELP | 第39-41页 |
| ·样品处理 | 第39页 |
| ·粗略估计其相变温度(Tt) | 第39-40页 |
| ·确定稀释倍数 | 第40页 |
| ·ITC循环过程 | 第40-41页 |
| ·大体积纯化条件的确定 | 第41页 |
| ·确定盐浓度降低Tt值至37℃ | 第41页 |
| ·大体积ITC循环 | 第41页 |
| ·利用His-tag标签纯化 | 第41-45页 |
| ·载体构建以及酶切和测序鉴定 | 第41-43页 |
| ·预表达 | 第43页 |
| ·摇瓶发酵并制备用于纯化的样品 | 第43页 |
| ·His-tag柱层析 | 第43-44页 |
| ·用脱盐柱脱盐 | 第44页 |
| ·His-tagWestern blot免疫杂交定性检测 | 第44-45页 |
| ·纯度鉴定 | 第45页 |
| 第二节 实验结果 | 第45-50页 |
| 1 利用ITC循环纯化 | 第45-47页 |
| ·Tt值的粗略估计 | 第45页 |
| ·稀释倍数 | 第45-46页 |
| ·小量纯化 | 第46页 |
| ·盐浓度的确定 | 第46页 |
| ·完整小量纯化与大量纯化比较 | 第46-47页 |
| 2 利用His-tag标签纯化 | 第47-50页 |
| ·所构建载体的双酶切鉴定和测序分析 | 第47-48页 |
| ·预表达 | 第48-49页 |
| ·柱层析 | 第49页 |
| ·His-tag免疫杂交 | 第49-50页 |
| ·纯度鉴定 | 第50页 |
| 第三节 讨论与分析 | 第50-52页 |
| 1 Tt值的粗略估计 | 第50-51页 |
| 2 稀释倍数 | 第51页 |
| 3 盐浓度的确定 | 第51页 |
| 4 Western blot免疫杂交 | 第51页 |
| 5 两种纯化方法优缺点比较 | 第51-52页 |
| 第四节 总结 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-60页 |
| 附录 | 第60-70页 |
| 附录Ⅰ 英文缩略词 | 第60-61页 |
| 附录Ⅱ 测量总蛋白的考马斯染料结合分析 | 第61-62页 |
| 附录Ⅲ 图示递归定向连接技术 | 第62-64页 |
| 附录Ⅳ 图示设计过程各步产物 | 第64-65页 |
| 附录Ⅴ 柱层析色谱图和峰积分 | 第65-67页 |
| 附录Ⅵ DNA测序图 | 第67-70页 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
