| 目录 | 第1-9页 |
| 中文摘要 | 第9-12页 |
| 英文摘要 | 第12-15页 |
| 前言 | 第15-43页 |
| 一、真核基因表达调控的遗传和表观遗传机制 | 第15-16页 |
| 二、染色质水平的调控是基因转录调控的重要部分 | 第16-35页 |
| 1.组蛋白修饰是基因表达在染色质水平调控的重要方式之一 | 第17-22页 |
| ·组蛋白密码 | 第18-20页 |
| ·组蛋白H3K4的双甲基化修饰是基因转录潜能的标志 | 第20-21页 |
| ·组蛋白的乙酰化修饰与转录活性紧密相关 | 第21-22页 |
| ·不同组蛋白修饰形成转录活性的常染色质结构和转录沉默的异染色质结构 | 第22页 |
| 2.DNA水平的转录调控与染色质结构密切相关 | 第22-29页 |
| ·启动子区染色质结构的局部开放是基因活跃转录的前提 | 第23页 |
| ·远距离增强子参与形成广泛开放的活性染色质结构域 | 第23-26页 |
| ·隔离子元件的增强子隔离作用与染色质结构密切相关 | 第26-29页 |
| 3.基因间转录参与转录调控并与染色质结构密切相关 | 第29-35页 |
| ·基因间转录过程参与基因激活 | 第29-34页 |
| ·基因间转录与大范围组蛋白修饰相关 | 第29-31页 |
| ·RNA polⅡ转录延伸复合物携带与组蛋白修饰相关的酶 | 第31-32页 |
| ·基因间转录可能介导了增强子与启动子的相互作用 | 第32-34页 |
| ·基因间转录产物通过RNAi机制介导异染色质化及基因沉默 | 第34-35页 |
| 三、ApoAI/CIII/AIV/AV基因簇的表达调控 | 第35-40页 |
| 1.ApoAI/CIII/AIV/AV基因簇的结构 | 第35-36页 |
| 2.ApoAI/CIII/AIV/AV基因簇与脂类代谢以及心血管疾病 | 第36-37页 |
| 3.ApoAI/CIII/AIV/AV基因簇的表达调控 | 第37-40页 |
| ·ApoAI基冈簇的组织特异性表达 | 第37页 |
| ·ApoCIII增强子对apoAI基因簇的调控 | 第37-38页 |
| ·转录因子对apoAI基因簇的调控 | 第38-40页 |
| 四、染色质免疫沉淀(ChIP)方法的原理及应用 | 第40-41页 |
| 五、本研究的主要内容 | 第41-43页 |
| 材料和方法 | 第43-64页 |
| 一、实验材料 | 第43-46页 |
| 1.菌株和质粒 | 第43页 |
| 2.细胞系 | 第43-44页 |
| 3.实验动物 | 第44页 |
| 4.限制性内切酶及修饰酶 | 第44页 |
| 5.抗体 | 第44页 |
| 6.其它主要试剂 | 第44-45页 |
| 7.试剂盒 | 第45页 |
| 8.引物合成 | 第45页 |
| 9.主要仪器设备 | 第45-46页 |
| 二、实验方法 | 第46-64页 |
| 1.研究的基本技术路线 | 第46-47页 |
| 2.细胞的培养 | 第47-48页 |
| ·细胞培养条件 | 第47页 |
| ·细胞传代 | 第47页 |
| ·细胞的复苏和冻存 | 第47-48页 |
| 3.Apo CIII增强子和apo AV启动子体外相互作用可能性的确定 | 第48-54页 |
| ·含apo CIII增强子-apo AV启动子的载体的构建 | 第48-53页 |
| ·载体构建技术路线 | 第48-49页 |
| ·质粒的制备 | 第49-50页 |
| ·质粒的小量制备------碱裂解法 | 第49页 |
| ·BAC质粒的大量制备------聚乙二醇(PEG)纯化法 | 第49-50页 |
| ·载体去磷酸化 | 第50-51页 |
| ·插入片段PCR引物设计及扩增 | 第51页 |
| ·凝胶回收PCR产物 | 第51页 |
| ·连接 | 第51-52页 |
| ·转化 | 第52-53页 |
| ·感受态E.coli DH5α的制备 | 第52页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第52页 |
| ·感受态细胞的快速转化 | 第52-53页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第53页 |
| ·PCR鉴定插入片段 | 第53页 |
| ·质粒电泳鉴定 | 第53页 |
| ·酶切鉴定插入片段及插入方向 | 第53页 |
| ·测序鉴定插入片段 | 第53页 |
| ·瞬时转染 | 第53-54页 |
| ·荧光素酶表达的测定 | 第54页 |
| 4.半定量RT-PCR方法测定Caco-2和HepG2细胞系apoAI基因簇基冈转录水平 | 第54-56页 |
| ·总RNA的提取 | 第54-55页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第55页 |
| ·PCR引物及扩增条件 | 第55-56页 |
| 5.ChIP方法检测人apoAI基因簇在HepG2和Caco-2细胞系的组蛋白修饰状况 | 第56-59页 |
| ·固定细胞 | 第56页 |
| ·全细胞抽提物(whole-cell extract,WCE)的获得 | 第56页 |
| ·免疫沉淀 | 第56-57页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第57页 |
| ·PCR引物设计 | 第57-58页 |
| ·半定量PCR检测组蛋白修饰水平 | 第58-59页 |
| 6.人apoAI/CIII/AIV/AV基因簇转基因小鼠正常株系和增强子突变株系肝组织组蛋白修饰比较 | 第59-62页 |
| ·阳性转基因小鼠的鉴定 | 第59-60页 |
| ·转基因小鼠株系的选择及传代 | 第59页 |
| ·小鼠基因组DNA的提取 | 第59页 |
| ·PCR鉴定阳性转基因小鼠 | 第59-60页 |
| ·ChIP方法检测组蛋白修饰情况 | 第60-62页 |
| ·样品制备 | 第60页 |
| ·染色质免疫沉淀 | 第60-61页 |
| ·固定 | 第60页 |
| ·全细胞抽提物的获得 | 第60页 |
| ·免疫沉淀 | 第60页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第60-61页 |
| ·半定量PCR检测组蛋白修饰水平 | 第61页 |
| ·Real time PCR法检测小鼠mGAPDH组蛋白修饰水平 | 第61-62页 |
| 7.人apo AI/CIII/AIV/AV基因簇基因间转录产物的鉴定 | 第62-64页 |
| ·总RNA的提取 | 第62页 |
| ·DNase I处理去除痕量基因组DNA | 第62页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第62页 |
| ·半定量PCR反应 | 第62-64页 |
| 实验结果 | 第64-87页 |
| 1.Apo CIII增强子—apo AV启动子的报告基因瞬时转染实验 | 第64-69页 |
| ·含apo AV启动子和apo CIII启动子的载体构建 | 第64-65页 |
| ·含apo CIII增强子—apo AV启动子和apo CIII增强子—apoCIIl启动子的载体构建 | 第65-69页 |
| ·酶切鉴定 | 第65-66页 |
| ·测序鉴定 | 第66-69页 |
| ·报告基因荧光素酶测定 | 第69页 |
| 2.Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇在HepG2和Caco-2细胞系的转录水平比较 | 第69-71页 |
| 3.Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇在HepG2和Caco-2细胞系的组蛋白修饰分析 | 第71-75页 |
| ·Apo AI基因簇细胞特异性组蛋白H3乙酰化修饰 | 第73-74页 |
| ·Apo AI基因簇组织特异性组蛋白H3K4甲基化修饰 | 第74-75页 |
| 4.人Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇转基因小鼠正常株与增强子删除株的组蛋修饰比较 | 第75-81页 |
| ·ApoAI基因簇组蛋白H3乙酰化水平比较 | 第78-79页 |
| ·ApoAI基因簇组蛋白H3K4甲基化水平比较 | 第79-81页 |
| 5.Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇基因间转录分析 | 第81-85页 |
| ·HepG2和Caco-2细胞系中ApoAI基因簇基冈间转录产物分析 | 第81-82页 |
| ·人Apo AI基因簇转基因小鼠的肝、肠组织基因间转录产物分析 | 第82-83页 |
| ·人ApoAI基因簇转基因小鼠增强子突变株的apoAI-apoCIII间区及apoAIV-apoCIlI间区的转录水平下降 | 第83-85页 |
| 6.Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇隔离子元件预测 | 第85-87页 |
| ·生物信息学分析存在核基质结合序列(MAR) | 第85-86页 |
| ·潜在的MAR与apo AIV之间存在局部的低组蛋白H3乙酰化和低H3K4甲基化修饰 | 第86-87页 |
| 讨论 | 第87-99页 |
| 1.Apo CIII增强子与apo AV启动子具有相互作用的潜能 | 第87-88页 |
| 2.Apo CIII增强子影响apoAI/CIII/AIV/AV基因簇的组蛋白修饰以调控基因转录 | 第88-92页 |
| ·ApoAI-apoCIII-apoAIV区的大范围组蛋白H3乙酰化修饰参与apo基因转录调控 | 第88-89页 |
| ·ApoAI-apoCIII-apoAIV区的组蛋白H3K4甲基化修饰结构域终止在apoAIV基因下游 | 第89-90页 |
| ·Apo AV启动子区独立于大范围开放的apo AI-apoCIII-apoAIV区染色质结构之外 | 第90页 |
| ·Apo CIII增强子参与建立apo AI-apoCllI-apoAIV区染色质结构的大范围开放 | 第90-92页 |
| 3.ApoCIII增强子调控apo AI-apoCIII及apoAIV-apoCIII基因间区转录 | 第92-94页 |
| ·Apo AI基因簇上广泛存在组织特异性基因间转录产物 | 第92页 |
| ·增强子调控apoAI-apoCIII及apoAIV-apoCIII基因间区转录 | 第92-94页 |
| 4.染色质隔离元件对apo AI/CIII/AIV/AV基因簇调控的可能性 | 第94-96页 |
| 5.本研究的不足之处及今后实验的设想 | 第96-99页 |
| ·关于ApoAI基因簇转基因小鼠模型作为染色质研究的可行性 | 第97页 |
| ·关于染色质结构分析 | 第97-98页 |
| ·展望 | 第98-99页 |
| 小结 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-113页 |
| 文献综述 | 第113-126页 |
| 英文名词及缩写 | 第126-129页 |
| 致谢 | 第129-130页 |
| 个人简历 | 第130页 |
