| 摘 要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 目 录 | 第7-11页 |
| 符 号 说 明 | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-34页 |
| ·激肽原酶简介 | 第13-16页 |
| ·人激肽原酶基因位点 | 第14-15页 |
| ·激肽原酶在人体组织的表达 | 第15-16页 |
| ·激肽原酶的测活方法 | 第16-18页 |
| ·生物检定法 | 第16页 |
| ·化学检定法 | 第16-17页 |
| ·物理检定法 | 第17-18页 |
| ·胰激肽原酶的生产研究 | 第18-23页 |
| ·生物提取的一般方法 | 第18-20页 |
| ·激肽原酶的生物提取 | 第20-22页 |
| ·重组人激肽原酶的研究 | 第22-23页 |
| ·激肽原酶与疾病 | 第23-24页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第24-30页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第25-26页 |
| ·宿主菌株 | 第26-27页 |
| ·外源基因的转化 | 第27-28页 |
| ·分泌蛋白的糖化特征 | 第28页 |
| ·外源蛋白表达优化 | 第28-30页 |
| ·有关的实验技术 | 第30-33页 |
| ·质粒的提取与纯化 | 第30-31页 |
| ·DNA的凝胶电泳 | 第31-32页 |
| ·常用的肽类分析技术 | 第32-33页 |
| ·本课题意义及设计思路 | 第33-34页 |
| 第二章 重组质粒pPIC9K/hPK的构建及菌株的筛选 | 第34-42页 |
| ·材料和方法 | 第34-39页 |
| ·材料 | 第34-35页 |
| ·试剂及溶液 | 第35页 |
| ·pPIC9K/hPK重组质粒的构建过程 | 第35页 |
| ·pPIC9K/hPK质粒的提取 | 第35-37页 |
| ·pPIC9K/hPK质粒的检验 | 第37页 |
| ·pPIC9K/hPK质粒线性化 | 第37-38页 |
| ·制备GS115感受态细胞 | 第38页 |
| ·电转化 | 第38页 |
| ·筛选His+Muts阳性克隆 | 第38-39页 |
| ·G418筛选高拷贝转化子 | 第39页 |
| ·结果与讨论 | 第39-41页 |
| ·pPIC9K/hPK重组质粒浓度与纯度的测定 | 第39页 |
| ·pPIC9K/hPK质粒酶切鉴定。 | 第39-40页 |
| ·His+Muts阳性克隆 | 第40页 |
| ·高拷贝转化子的筛选 | 第40-41页 |
| 本章小结 | 第41-42页 |
| 第三章 目的蛋白的诱导表达与分析 | 第42-49页 |
| ·实验材料 | 第42页 |
| ·试剂 | 第42页 |
| ·仪器设备 | 第42页 |
| ·实验操作 | 第42-46页 |
| ·重组人胰激肽原酶的诱导表达 | 第42-43页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第43-45页 |
| ·糖基化的鉴定 | 第45-46页 |
| ·结果与讨论 | 第46-48页 |
| 本章小结 | 第48-49页 |
| 第四章 重组人胰激肽原酶的分离纯化 | 第49-58页 |
| ·发酵条件初步优化及分离 | 第49-51页 |
| ·材料与仪器 | 第49页 |
| ·重组人胰激肽原酶的摇瓶表达 | 第49-50页 |
| ·发酵条件的初步优化 | 第50页 |
| ·分离纯化 | 第50-51页 |
| ·蛋白定量测定方法的选择 | 第51-54页 |
| ·二喹啉甲酸BCA检测法 | 第51-52页 |
| ·考马斯亮蓝检测法(Coomassie blue G | 第52-54页 |
| ·结果与讨论 | 第54-57页 |
| ·蛋白定量测定方法结果比较 | 第54-55页 |
| ·发酵条件优化结果 | 第55-56页 |
| ·离子交换柱的选择 | 第56-57页 |
| 本章小结 | 第57-58页 |
| 第五章 重组人胰激肽原酶酶活的测定 | 第58-64页 |
| ·试剂及仪器 | 第58-59页 |
| ·重组人胰激肽原酶(hPK)的酶切活化 | 第59-60页 |
| ·hPK的前端小肽酶切 | 第59页 |
| ·hPK酶原的活化 | 第59页 |
| ·酶切反应停止 | 第59-60页 |
| ·重组人胰激肽原酶的活性及动力学参数测定 | 第60-61页 |
| ·原理 | 第60页 |
| ·测定方法 | 第60-61页 |
| ·酶促反应动力学参数测定 | 第61页 |
| ·结果与讨论 | 第61-63页 |
| ·酶活测定结果 | 第61-62页 |
| ·酶促反应动力学 | 第62-63页 |
| 本章小结 | 第63-64页 |
| 结论与展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-69页 |
| 附录一 培养基 | 第69-71页 |
| 附录二 缓冲液 | 第71页 |
| 附录三 培养基中残余甘油量的测定 | 第71-72页 |
| 附录四 阴离子交换层析柱特征表 | 第72-73页 |
| 附录五 人胰激肽原酶氨基酸序列图 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 攻读硕士学位期间发表文章 | 第75页 |