| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-9页 |
| 一 前言 | 第9-20页 |
| 1 核酶RNase P简介 | 第9-15页 |
| 1．1 大肠杆菌RNase P的组成与来源 | 第10-11页 |
| 1．2 RNase P催化亚单位M1 RNA的高级结构 | 第11-12页 |
| 1．3 大肠杆菌来源RNase P的催化反应机理 | 第12-13页 |
| 1．4 大肠杆菌来源RNase P催化亚单位M1 RNA的体外切割活性影响因素 | 第13-15页 |
| 2 人工设计核酶引导序列 | 第15-17页 |
| 3 课题意义 | 第17-20页 |
| 3．1 HCMV简介 | 第17-18页 |
| 3．2 RNase P对于治疗HCMV感染的研究意义 | 第18-20页 |
| 二 技术路线 | 第20-21页 |
| 三 材料和方法 | 第21-41页 |
| 1 主要仪器 | 第21页 |
| 2 实验材料 | 第21-24页 |
| 2．1 质粒和菌种 | 第21-22页 |
| 2．2 寡核苷酸片段 | 第22页 |
| 2．3 主要试剂 | 第22页 |
| 2．4 其它主要试剂的配方 | 第22-24页 |
| 3 实验方法 | 第24-41页 |
| 3．1 克隆UL54 | 第24-28页 |
| 3．1．1 技术路线 | 第24-25页 |
| 3．1．2 UL54基因两端引物设计 | 第25页 |
| 3．1．3 PCR扩增UL54基因 | 第25页 |
| 3．1．4 pGEM3z质粒载体的制备 | 第25-26页 |
| 3．1．5 对基因和载体双酶切、连接 | 第26-27页 |
| 3．1．6 制备感受态宿主菌 | 第27页 |
| 3．1．7 转化 | 第27页 |
| 3．1．8 对转化子快速鉴定与测序 | 第27-28页 |
| 3．2 设计M1GS核酶 | 第28-29页 |
| 3．2．1 验证M1重组质粒pFL117 | 第28页 |
| 3．2．2 搜寻GS互补靶位点 | 第28页 |
| 3．2．3 设计M1GS上下游引物 | 第28-29页 |
| 3．3 M1GS核酶DNA模板的制备 | 第29-30页 |
| 3．3．1 PCR扩增M1GS | 第29页 |
| 3．3．2 PCR产物末端平滑处理 | 第29-30页 |
| 3．4 亚克隆UL54基因片段 | 第30-32页 |
| 3．4．1 克隆片段的选择 | 第30-32页 |
| 3．4．2 UL54基因小片段克隆的引物设计 | 第32页 |
| 3．4．3 UL54小片段克隆与筛选 | 第32页 |
| 3．5 体外转录 | 第32-38页 |
| 3．5．1 M1GS核酶的体外转录 | 第32-34页 |
| 3．5．2 底物基因片段的体外转录 | 第34-35页 |
| 3．5．2．1 UL54小片段克隆质粒的处理 | 第34页 |
| 3．5．2．2 体外转录UL54基因各底物片段 | 第34-35页 |
| 3．5．3 RNA Marker的制备 | 第35-38页 |
| 3．5．3．1 确定RNA Marker的材料来源 | 第35-36页 |
| 3．5．3．2 制备RNA Marker的DNA模板 | 第36页 |
| 3．5．3．3 RNA Marker的体外转录 | 第36-37页 |
| 3．5．3．4 Marker的体外转录结果 | 第37-38页 |
| 3．6 M1GS核酶对底物RNA片段的体外切割实验 | 第38页 |
| 3．7 凝胶电泳与放射自显影 | 第38-40页 |
| 3．7．1 凝胶电泳 | 第38-39页 |
| 3．7．1．1 凝胶的制备 | 第38-39页 |
| 3．7．1．2 电泳条件 | 第39页 |
| 3．7．1．3 电泳后处理 | 第39页 |
| 3．7．2 放射自显影 | 第39-40页 |
| 3．8 M1GS切割效率的影响因素 | 第40页 |
| 3．8．1 底物高级结构对M1GS核酶体外切割效率的影响 | 第40页 |
| 3．8．2 不同核酶／底物比例下M1GS体外切割现象的变化 | 第40页 |
| 3．9 M1GS核酶的酶活力计算 | 第40-41页 |
| 四 结果与分析 | 第41-58页 |
| 1 HCMV DNA聚合酶UL54基因的克隆与RNase P基因的鉴定 | 第41-43页 |
| 1．1 PU54质粒的构建与鉴定 | 第41-43页 |
| 1．2 pFL117质粒测序鉴定 | 第43页 |
| 2 人工M1GS核酶的设计 | 第43-46页 |
| 2．1 人工M1GS的靶位确定 | 第43-46页 |
| 2．2 M1GS体外转录模板的构建 | 第46页 |
| 3 人工核酶M1GS的体外切割 | 第46-54页 |
| 3．1 底物片段的体外转录 | 第46-48页 |
| 3．2 核酶的体外转录 | 第48-50页 |
| 3．3 人工核酶M1GS对底物的体外切割 | 第50-54页 |
| 3．3．1 体外切割产物的理论预计 | 第50页 |
| 3．3．2 核酶与底物的体外切割产物电泳检测结果 | 第50-54页 |
| 4 影响人工核酶M1GS体外切割效果的因素 | 第54-58页 |
| 4．1 底物RNA高级结构的影响 | 第54-57页 |
| 4．2 底物与核酶的反应比例对M1GS体外切割活性的影响 | 第57-58页 |
| 五 M1GS二级结构预测及核酶与底物相互作用模拟 | 第58-73页 |
| 1 人工核酶M1GS相关二级结构预测 | 第58-65页 |
| 1．1 bridge RNA与M1 RNA二级结构 | 第58-59页 |
| 1．2 88nt bridge RNA的二级结构特点 | 第59-60页 |
| 1．3 对bridge RNA的理论筛选 | 第60-62页 |
| 1．4 GS序列与bridge RNA二级结构 | 第62-65页 |
| 2 M1GS与底物相互作用模拟 | 第65-73页 |
| 2．1 底物二级结构预测 | 第65-68页 |
| 2．2 M1GS与靶位相互作用自由能预测 | 第68-73页 |
| 六 讨论 | 第73-85页 |
| 1 关于M1GS的设计 | 第73-77页 |
| 2 关于底物片段的处理 | 第77-78页 |
| 3 关于M1GS核酶的非预定靶位切割 | 第78-84页 |
| 4 底物与核酶的比例 | 第84-85页 |
| 七 结论与展望 | 第85-87页 |
| 八 略缩词中英文对照 | 第87-88页 |
| 九 附录 | 第88-103页 |
| 附录1 RNase一览 | 第88-89页 |
| 附录2 UL54基因全长测序结果（序列） | 第89-91页 |
| 附录3 genebank公布UL54基因全序列 | 第91-95页 |
| 附录4 M1 RNA基因测序结果（序列） | 第95-96页 |
| 附录5 genebank公布M1 RNA基因全序列 | 第96-97页 |
| 附录6 UL54基因测序图谱报告 | 第97-102页 |
| 附录7 M1 RNA基因测序图谱报告 | 第102-103页 |
| 十 参考文献 | 第103-107页 |
| 致谢 | 第107页 |
