| 中文摘要 | 第1-12页 |
| 英文摘要 | 第12-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-53页 |
| 综述一 转基因技术研究概况 | 第15-22页 |
| 1 转基因动物研究发展概况 | 第15页 |
| 2 转基因技术 | 第15-19页 |
| (1) 显微注射法 | 第15-16页 |
| (2) 精子载体法 | 第16-17页 |
| (3) 逆转录病毒载体法 | 第17页 |
| (4) 胚胎干细胞介导法 | 第17-18页 |
| (5) 体细胞核移植技术 | 第18页 |
| (6) 转基因克隆动物技术 | 第18-19页 |
| 3 转基因动物研究中存在的主要问题和解决办法 | 第19-22页 |
| 综述二 动物基因敲除研究现状与展望 | 第22-35页 |
| 1 基因敲除研究概况 | 第22-29页 |
| (1) 历史回顾 | 第22-23页 |
| (2) 基因敲除的基本原理 | 第23-24页 |
| (3) 基因敲除筛选模式及其策略 | 第24-27页 |
| (4) 组织特异性基因敲除 | 第27-29页 |
| 2 大动物基因敲除的现状及其应用 | 第29-35页 |
| (1) 现状 | 第29-30页 |
| (2) 基因敲除技术在大动物中的应用进展 | 第30-35页 |
| ① 疾病模型与临床治疗上 | 第30-32页 |
| ② 异种器官移植 | 第32页 |
| ③ 动物育种上 | 第32页 |
| ④ 基因结构与功能关系 | 第32-33页 |
| ⑤ 转基因动物研究上 | 第33-35页 |
| 综述三 Myostatin基因研究进展 | 第35-51页 |
| 1 肌肉生长抑制素基因的发现 | 第35页 |
| 2 肌肉生长因子抑制素基因的研究现状 | 第35-46页 |
| (1) 转化生长因子(TGF-)及其信号转导 | 第35-37页 |
| (2) Myostatin基因特点 | 第37-39页 |
| (3) Myostatin基因定位 | 第39-40页 |
| (4) Myostatin基因的表达 | 第40-41页 |
| (5) Myostatin基因的转译调控 | 第41-43页 |
| (6) Myostatin与GDF-11 | 第43-44页 |
| (7) Myostatin与脂肪积累(fat accumulation) | 第44-45页 |
| (8) Myostatin与肌肉衰竭和再生(muscle misuse and regeneration) | 第45-46页 |
| 3 Myostatin作用机理 | 第46-48页 |
| (1) Myostatin合成与加工位点 | 第46页 |
| (2) Myostatin通过控制细胞周期进程控制成肌细胞数量 | 第46-48页 |
| 4 Myostatin基因应用前景 | 第48-50页 |
| (1) 畜牧生产上 | 第48-49页 |
| (2) 医学上 | 第49-50页 |
| 5 展望 | 第50-51页 |
| 本课题的研究意义、研究内容与技术路线 | 第51-53页 |
| 1 研究意义 | 第51-52页 |
| (1) 研究在绵羊体细胞中敲除myostatin基因的可能性 | 第51页 |
| (2) 建立家畜体细胞基因敲除技术体系 | 第51页 |
| (3) 医学上 | 第51-52页 |
| 2 研究内容 | 第52页 |
| 3 技术路线 | 第52-53页 |
| 第二部分 实验研究 | 第53-104页 |
| 第一章 Myostatin基因敲除载体和mAAT基因定点整合载体的构建 | 第53-78页 |
| 1 实验材料 | 第54-55页 |
| 2 主要方法 | 第55-64页 |
| ·主要溶液的配制 | 第55-57页 |
| ·哺乳动物血样基因组DNA的提取 | 第57页 |
| ·CaCl_2法感受态细胞的制备与转化 | 第57-58页 |
| ·电击法感受态细胞的制备与效价测定 | 第58-59页 |
| ·PCR反应体系与产物鉴定 | 第59页 |
| ·外源片段的回收:glassmilk法和QIAGEN QIAEX Ⅱ protocol | 第59-60页 |
| ·连接反应体系的确定 | 第60页 |
| ·重组质粒大小的快速鉴定:Cracking法 | 第60页 |
| ·质粒DNA的小量和大量制备 | 第60-62页 |
| ·质粒DNA的酶切鉴定 | 第62页 |
| ·DNA末端补平方法 | 第62-63页 |
| ·DNA序列测定 | 第63-64页 |
| 3 结果与分析 | 第64-74页 |
| ·绵羊Myostatin基因敲除载体及定点整合mAAT基因载体构建 | 第64-73页 |
| (1) 靶位DNA片段的克隆 | 第64-65页 |
| (2) 同源臂T-载体克隆质粒的酶切鉴定、序列测定及分析 | 第65-68页 |
| (3) 绵羊myostatin基因敲除载体构建线路图 | 第68页 |
| (4) mAAT基因定点整合载体构建线路图 | 第68-73页 |
| ·质粒pLoxp-1.4K-4.3K的PCR及酶切鉴定 | 第73页 |
| ·质粒pM-AAT的PCR和酶切鉴定 | 第73-74页 |
| 4 讨论 | 第74-78页 |
| 第二章 绵羊胎儿及成年Dorset母羊成纤维细胞系的建立 | 第78-89页 |
| 1 材料与方法 | 第78-83页 |
| ·材料 | 第78-80页 |
| ·主要实验方法 | 第80-83页 |
| (1) 绵羊胎儿成纤维细胞的分离与培养:胰酶消化培养法 | 第80页 |
| (2) 成年雌性Dorset绵羊耳部成纤维细胞的分离与培养:贴壁培养法 | 第80-81页 |
| (3) 细胞系的传代、冷冻与复苏 | 第81页 |
| (4) 染色体核型分析 | 第81-82页 |
| (5) SRY-PCR法鉴定胎儿成纤维细胞系性别 | 第82页 |
| (6) 细胞系模板DNA的提取 | 第82-83页 |
| 2 实验结果 | 第83-87页 |
| (1) 绵羊成纤维细胞的分离及培养建系 | 第83-85页 |
| (2) 绵羊成纤维细胞系的染色体核型分析 | 第85页 |
| (3) 绵羊胎儿成纤维细胞系的SRY-PCR法性别鉴定结果 | 第85-87页 |
| 3 讨论 | 第87-89页 |
| 第三章 外源DNA转染绵羊成纤维细胞及其阳性细胞克隆的检测与鉴定 | 第89-104页 |
| 1 材料与方法 | 第89-95页 |
| ·试剂与培养皿 | 第89-90页 |
| ·主要仪器 | 第90页 |
| ·主要实验方法 | 第90-91页 |
| ·传染方法 | 第91-93页 |
| ·PCR检测药物抗性细胞克隆 | 第93页 |
| ·阳性细胞克隆核移植后胚胎发育能力评定 | 第93-95页 |
| 2 实验结果 | 第95-100页 |
| (1) 毒性敏感性检测结果 | 第95-96页 |
| (2) 不同基因结构、不同转染方法及不同细胞系的转染效率的比较 | 第96-97页 |
| (3) 抗性细胞克隆的分离与培养 | 第97页 |
| (4) PCR检测结果 | 第97-99页 |
| (5) 阳性细胞克隆核移植后的胚胎发育情况 | 第99-100页 |
| 3 讨论 | 第100-104页 |
| ·外源基因转移方法 | 第100页 |
| ·基因打靶效率计算 | 第100页 |
| ·关于药物抗性细胞的单克隆培养 | 第100页 |
| ·外源基因转移方法对同源重组效率的影响 | 第100-101页 |
| ·不同载体类型对同源重组效率的影响 | 第101页 |
| ·转染用细胞基因型对同源重组效率的影响 | 第101-102页 |
| ·体细胞的长期培养问题 | 第102页 |
| ·细胞融合方法与供体细胞类型的选择 | 第102页 |
| ·细胞培养代数对核移植的影响 | 第102-104页 |
| 结论 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-118页 |
| 附件Ⅰ 测序扫描图 | 第118-120页 |
| 附件Ⅱ 博士期间发表论文情况 | 第120-121页 |
| 致谢 | 第121页 |
