人血小板生成素重组细胞的培养工艺研究
| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-13页 |
| 前言 | 第13-21页 |
| 实验材料 | 第21-26页 |
| 一、 主要仪器 | 第21-22页 |
| 二、 质粒和细胞 | 第22页 |
| 三、 试剂 | 第22页 |
| 四、 溶液 | 第22-24页 |
| 五、 培养基和胰酶 | 第24-25页 |
| 六、 柱填料 | 第25页 |
| 七、 实验动物 | 第25-26页 |
| 实验方法 | 第26-36页 |
| 一、 表达细胞株的构建 | 第26-27页 |
| 1． 宿主细胞培养 | 第26页 |
| 2． 表达载体转染宿主细胞 | 第26-27页 |
| 二、 筛选表达细胞株 | 第27页 |
| 1． 初级筛选 | 第27页 |
| 2． 复筛（扩大表达量） | 第27页 |
| 三、 克隆细胞株的鉴定 | 第27-30页 |
| 1． Northern Blot分析 | 第27-28页 |
| 2． 重组细胞表达量的测定 | 第28页 |
| 3． TPO基因拷贝数分析 | 第28-29页 |
| 4． 重组细胞外源因子检测 | 第29页 |
| 5． 重组细胞核型分析 | 第29-30页 |
| 6． 重组细胞致瘤性测定 | 第30页 |
| 四、 TPO生物活性测定 | 第30-31页 |
| 1． 体外生物活性测定 | 第30-31页 |
| 2． 体内生物活性测定 | 第31页 |
| 五、 细胞培养 | 第31-32页 |
| 1． 细胞瓶培养 | 第31页 |
| 2． 细胞冻存 | 第31页 |
| 3． 细胞复苏 | 第31页 |
| 4． 细胞罐培养 | 第31-32页 |
| 5． 葡萄糖含量测定 | 第32页 |
| 六、 产物纯化 | 第32-34页 |
| 1． 超滤 | 第32页 |
| 2． 染料亲和层析 | 第32-33页 |
| 3． 植物凝集素亲和层析 | 第33页 |
| 4． 凝胶层析（G-25） | 第33页 |
| 5． 离子交换层析 | 第33页 |
| 6． 反相高效液相层析 | 第33页 |
| 7． 疏水层析 | 第33页 |
| 8． 凝胶层析（S-200） | 第33-34页 |
| 七、 产品鉴定 | 第34-36页 |
| 1． 电泳和免疫印记分析 | 第34页 |
| 2． HPLC分析 | 第34页 |
| 3． 肽图分析 | 第34页 |
| 4． 等电点分析 | 第34页 |
| 5． 糖和唾液酸分析 | 第34-36页 |
| 实验结果 | 第36-62页 |
| 一、 TPO表达细胞株的构建和筛选 | 第36-40页 |
| 二、 TPO活性检测方法的建立 | 第40-43页 |
| 1． 体外生物活性测定 | 第40-43页 |
| 2． 体内生物活性测定 | 第43页 |
| 三、 重组细胞株的鉴定 | 第43-48页 |
| 1． 重组细胞培养条件的确定 | 第43-44页 |
| 2． 重组细胞中目的基因的确定 | 第44页 |
| 3． 重组细胞中基因拷贝数的测定 | 第44-46页 |
| 4． 重组细胞表达稳定性研究 | 第46-47页 |
| 5． 重组细胞形态检查 | 第47页 |
| 6． 重组细胞外源因子检查 | 第47页 |
| 7． 重组细胞致瘤性检查 | 第47-48页 |
| 8． 重组细胞核型检查 | 第48页 |
| 四、 重组细胞表达TPO条件的确定 | 第48-50页 |
| 五、 重组细胞的细胞罐培养和表达 | 第50-54页 |
| 六、 表达产物的纯化 | 第54-59页 |
| 七、 表达产物的鉴定 | 第59-62页 |
| 1． 生物活性 | 第59页 |
| 2． 电泳及免疫印记分析 | 第59页 |
| 3． HPLC分析纯度 | 第59-60页 |
| 4． N端氨基酸序列测定 | 第60页 |
| 5． 肽图分析 | 第60页 |
| 6． 质谱分析 | 第60页 |
| 7． 等电点分析 | 第60页 |
| 8． 糖含量和唾液酸含量分析 | 第60-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 讨论 | 第63-66页 |
| 参考文献 | 第66-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
